А
Б В
Г Д
Е Ж
З И
К Л
М Н
О П
Р С
Т У
Ф Х
Ц Ч
Ш Э
Ю Я
Реферат: Разработка метода для исследования неконтактного влияния антрацена на локомоторную активность спермы быка
Разработка метода для исследования неконтактного влияния антрацена на локомоторную активность спермы быка
Insamantarile artificiale la animalele domestice
Insamantarile artificiale reprezinta o biotehnica moderna a reproducerii animalelor, care asigura progresul genetic al efectivelor si implicit sporirea productivitatii acestora.
Insamantarea artificiala inlatura controlul sexual dintre mascul si femela, sperma fiind recoltata de la un reproducator mascul si depusa in organele genitale ale unei femele aflate in calduri, cu ajutorul unui instrumentar adecvat.
Desi in literatura de specialitate nu exista date precise despre inceputul aplicarii insamantarilor artificiale, se considera, totusi ca prima incercare a fost facuta de catre arabi, in secolul XIV, obtinand un produs de la un armasar valoros, prin prelevarea spermei cu un smoc de par introdus in vaginul unei iepe si extras dupa monta acesteia, si apoi introdus imediat in vaginul altei iepe in calduri.
Date sigure au stabilit ca insamantarile artificiale au fost aplicate inca in secolul XVIII. Astfel se cunoaste faptul ca fiziologul italian Lazzaro Spallanzani in anul 1778, inoculand unei catele sperma recoltata, prin masturbatie, de la un caine a obtinut trei produsi. Experiente asemanatoare, cu rezultate bune au fost efectuate in secolul al XIX-lea de catre Everett, Millais, Albrecht.
Studii aprofundate, bazate pe cercetari experimentale, au fost efectuate pentru prima data de fiziologul rus Ilia Ivanov (1860-1932), considerat pe drept cuvant, fondator al insamantarilor artificiale. Punand bazele teoretice si practice ale insamantarilor artificiale, Ivanov a aplicat, in perioada 1889-1932, aceasta metoda la diferite specii (cabaline, bovine, ovine, porcine), mai intai ca mijloc profilactic pentru prevenirea bolilor infectioase si parazitare transmisibile prin monta, si apoi ca metoda de ameliorare a raselor de animale. La scoala creata de Ivanov s-au format specialisti de prestigiu care au elaborat valorase studii despre tehnologia insamantarilor artificiale, biochimia spermei, perfectionarea aparaturii si instrumentarului.
Insamantarile artificiale au inregistrat o larga raspandire intr-o perioada de timp relativ scurta datorita avantajelor mari pe care le prezinta in ameliorarea animalelor. Astfel, Danemarca, Japonia si Israelul utilizeaza, practic, numai insamantarea artificiala la taurinele pentru lapte si la suine. Metoda are extindere mare in SUA, tarile din Europa si Asia. Importanta insamantarilor artificiale se manifesta sub diferite aspecte: zootehnic, economic, sanitar-veterinar si stiintific.
Gratie cresterii substantiale a eficientei utilizarii materialului seminal, prin aplicarea insamantarilor artificiale este posibila folosirea celor mai valorosi reproducatori masculi, testati dupa descendenta si cu insusiri morfo-productive deosebite, care intensifica progresul genetic-ameliorativ al efectivelor intr-un timp scurt. Astfel, un taur testat poate avea pe durata vietii intre 100.000 si 200.000 produsi, vierul – peste 1000 intr-un an, iar un armasar – peste 100 manji pe sezon.
La speciile cu un interval mare intre generatii, asocierea biotehnicii insamantarilor artificiale cu conservarea prin congelare a spermei permite crearea unor banci de material seminal, care este unilizat dupa finalizarea la taurii de 6 sau 7 ani a testului de performare dupa prima lactatie normala a fiicelor. In plus, peste 90% din caracterele morfoproductive care au un determinism genetic pot fi ameliorate prin folosirea insamantarilor artificiale.
Prin folosirea unui numar redus de reproducatori in centre specializate de reproductie, cu sperma carora pot sa fie insamantate un numar mare de femele se realizeaza economii insemnate de forta de munca, de furaje, de adaposturi, putand fi intretinuti in conditii foarte bune reproducatorii de mare valoare genetica.
Intretinerea masculilor reproducatori in ferme specializate permite mentinerea lor in conditii optime de sanatate si intretinere, cu o productie seminala de calitate si indemna de boli cu transmitere veneriana (bruceloza, tricomonoza, vibrioza). Garantarea indemnitatii spermei fata de principalele boli infecto-contagioase face posibil schimbul international de gene prin importul exportul de material seminal congelat, fara suportarea inconvenientelor prilejuite de carantina.
Derularea diferitelor etape ale insamantarilor artificiale majoreaza substantial aportul factorului uman la procesul reproducerii, fapt care face necesara intocmirea si pastrarea unor evidente complete reducand prin aceasta pericolul transmiterii prin mostenire a unor boli genetice.
Alte avantaje ale insamantarilor artificiale se refera la reproducerea artificiala a unor specii monogame (vulpile) si obtinerea de hibrizi intre specii, care in mod natural nu se imperecheaza (intre magar si iapa, intre vaca si Iac, intre bizonul european si bizonul american etc.).
Insamantarea artificiala comporta si unele dezavantaje. Ele rezida in urmatoarele:
folosirea reproducatorilor necorespunzatori din punct de vedere genetic are actiune negativa asupra ameliorarii. De aceea, este absolut necesar sa se foloseasca masculi de origine cunoscuta, testati dupa descendenta;
posibilitatea comiterii unor erori in etapele prelucrarii, conservarii, transportului, depistarii caldurilor si insamantarea femelelor de catre persoanele antrenate in procesul de munca.
Prin neglijarea profilaxiei bolilor genetice, insamantarile artificiale pot favoriza diseminarea unor boli, cum ar fi: boala chistica ovariana, sindromul spastic, criptorhidia si defecte de conformatie.
Toate aceste neajunsuri pot fi inlaturate in cazul existentei in reteaua insamantarilor artificiale a unui personal calificat, care sa posede cunostinte de biologia si patologia reproductiei, precum si de ameliorare.
Teoria si practica insamantarilor artificiale la animalele domestice cuprinde urmatoarele compartimente:
studiul spermei;
metodele de recoltare a spermei;
controlul si diluarea spermei;
metodele de conservare a spermei;
inocularea spermei sau insamantarea propriu-zisa.
Sperma
Sperma reprezinta un produs complex al aparatului genital mascul constituit din spermatozoizi si plasma seminala.
Plasma seminala este alcatuita din fluidul testicular secretat de canaliculele testiculare, la care se adauga, succesiv, secretia epididimului si a canalelor deferente, Cantitatea cea mai mare de lichid seminal cu rol biologic foarte important este secretata de glandele anexe ale aparatului genital: glandele seminale, prostata si glandele bulbo-uretrale.
Sperma eliminata de un mascul in timpul unui act coital poarta denumirea de ejaculat.
Particularitatile de structura ale organelor genitale si dinamismul actului coital determina variatii atat in volumul ejaculatului, cat si in compozitia lui la masculii de diferite specii. Astfel, volumul ejaculatului la armasar este de 60-80ml, maximum 200ml, la vier – respectiv 200-500 si 1000ml, la berbec – 1-2 si 3,5ml, la taur – 4-5ml si 15 ml, la caine – 8-10 si 25ml, la cocos – 0,3 si 2ml, la curcan – 0,25-0,4 si la gascan 0,1-1,3ml.
In functie de specie este diferita si concentratia spermei. La animalele de tip vaginal de insamantare naturala concentratia spermiilor este de 5-10 ori mai mare in comparatie cu cea la animalele de tip uterin de insamantare. Asa, intr-un mililitru de sperma se gasesc in mediu: la berbec – 2,5-3,5miliarde, la taur – 0,8-1,25miliarde, la vier – 0,15-0,21miliarde, la armasar – 0,1-0,15miliarde, la cocos – 2-4miliarde, la curcan – 2-4miliarde si la gansac – 0,3-1miliard de spermi.
Raportul dintre spermi si plasma seminala este diferit, in dependenta de specie si este in corelatie cu volumul ejaculatului si mai ales cu dezvoltarea glandelor anexe. In sperma, spermii reprezinta 36% - la berbec, 14% - la taur, 7% - la vier si numai 1,75% - la armasar.
Compozitia chimica a spermei
Din punct de vedere al compozitiei chimice, sperma face parte din cele mai complicate lichide ale organismului. Apa constituie circa 90-98% din masa spermei, iar 2-10% revine substantei uscate, dintre care 60% sunt proteine. Constituentii principali ai spermei sunt proteinele si lipidele. In compozitia proteinelor spermei sunt proteinele si lipidele. In compozitia proteinelor intra aminoacizi care contin sulf. Din lipidele spermatice, intr-o cantitate mai mare se contine lecitina, bogata in fosfor. In 100ml sperma de berbec se contin pana la 355mg de fosfor, la taur – 82mg, la vier – 66mg si la armasar – 19mg. El are un rol important in procesele biochimice ce se produc in spermi.
In sperma se contin elemente minerale. In forma combinata sau ca electroliti, dintre care e de mentionat: Sodiul, potasiul, calciul, magneziul, fosforul, zincul, clorurile, fosfatii etc. Zincul joaca un rol important in procesul fecundatiei, stimuland in acelasi timp actiunea hormonilor androgeni.
Constituentii organici din sperma au rol deosebit in biologia spermilor, concretizat prin: asigurarea substratului energetic necesar metabolismului spermilor; actiune protectoare asupra gametilor, prin neutralizarea efectului daunator al unor constituenti anorganici din sperma; prevenirea aglutinarii spermilor etc. Dintre substantele organice, o mare importanta prezinta: fructoza, acidul citric, inozitolul, fosforil-colina si fosforil-gliceril-colina.
Fructoza este principalul glucid din sperma. Ea a fost depistata pentru data in sperma de taur; ulterior s-a descoperit si in sperma altor specii. Continutul de fructoza a spermei este, la 100ml, in medie de 540mg la taur, 247mg la berbec, 15mg la armasar, 12mg la vier. Secretatq yn cea mai mare parte de glandele seminale, fructoza constituie sursa principala de energie pentru spermi. Secretia fructozei este favorizata de testosteron, iar sinteza ei este conditionata de declansarea unor mecanisme hormonale. Exista o corelatie semnificativa intre cantitatea de fructoza din sperma si procentul de fecunditate obtinut. Determinarea indicelui de fructoliza constituie o metoda eficace pentru aprecierea calitatii spermei. Dintre alte substante de natura glucidica, in sperma se gasesc: glucoza, galactoza, arabinoza, riboza si ribuloza.
In afara de fructoza si de celelalte monozaharide sperma contine cantitati insemnate de sorbitol, secretat de glandele seminale. Sorbitolul serveste, de asemenea, ca sursa energetica pentru spermi, gasindu-se in cantitati care variaza in limite foarte mari in sperma diferitelor specii: la berbec – 26-120mg/100ml, la taur – 10-136mg/100ml, la vier – 6-18mg/100ml, la armasar – 20-60mg/100ml sperma.
Acidul citric este unul din constituentii caracteristici ai spermei, care indeplineste multiple roluri, cum sunt: activator al fosfatazei alcaline, absolut necesara in anumite faze ale glicolizei anaerobe; impreuna cu sodiul si potasiul, acidul citric contribuie la realizarea presiunii osmotice a lichidului spermatic. Ca si fructoza, este secretat in deosebi de glandele seminale, sub influenta testosteronului. Sarurile acidului citric (citratii) sunt elemente ale sistemului-tampon al spermei, de aceea adausul de citrat de sodiu in materialul seminal prelungeste termenul de viabilitate a spermilor. Sperma diferitelor specii contine, in medie, urmatoarele cantitati de acid citric la 100ml sperma: la taur – 720mg, la vier – 130mg, la berbec – 120mg, la armasar – 26mg. Starea de intretinere a animalului influenteaza continutul de acid citric din sperma influenteaza continutul de acid citric din sperma, ca si de celelalte substante reducatoare.
Inozitolul s-a descoperit initial in sperma de vier, fiind secretat de glandele seminale, avand o asemanare de structura cu glucoza si fructoza, face sa se presupuna ca ar juca rolul de intermediar chimic intre glucide si hormonii androgeni. Continutul de inozitol, la 100 ml sperma este: la vier 605-702mg, la taur 63,4mg, la berbec 40mg, la armasar 37,5mg.
Fosforil-colina si gliceril-fosforil-colina constituie continutul total al fosforului existent in plasma seminala. Gliceril-fosforil-colina este secretata, in principal, de epididim si se gaseste in cantitate destul de mare in sperma tuturor speciilor. In sperma, gliceril-fosforil-colina se gaseste ca atare, dar ea este descompusa in elemente mai simple (colina, fosfoglicerol, glicerol liber) sub actiunea enzimelor secretate de aparatul genital femel; din aceste considerente, gliceril-fosforil-colina constituie o sursa de energie pentru spermi dupa depunerea lor in organele genitale femele.
Prin determinari chimice, s-a constatat prezenta in sperma a vitaminelor A,C,D, a vitaminelor din complexul B, a vitaminei PP. Dintre acestea vitamina C este indispensabila viabilitatii spermilor, lipsa ei determinand cresterea procentului de infecunditate. Cantitatea de acid ascorbic in sperma este cu mult mai mare decat in sange (4-14mg% in sperma fata de 0,2-0,4mg% in sange). In 100g testicul se gasesc urmatoarele cantitati de vitamina C: la taur – 29,39mg, la armasar 46mg, la iepure 14mg.
Sperma contine hormoni steroizi elaborati de testicul. In sperma tuturor masculilor se gasesc hormoni androgeni, si in cantitate mai mica – hormoni estrogeni, cu exceptia spermei de armasar, unde estrogenii sunt in cantitate mai mare.
Lichidul seminal contine si Prostaglandina F2alfa in concentratii care nu depasesc 100mg/ml si care, prin actiunea ocitocica asupra miometrului, favorizeaza transportul spermilor in caile genitale femele.
Atat lichidul spermatic, cat si spermii contin numeroase enzime cu importanta deosebita, mai ales pentru activitatile vitale ale celulelor seminale. Din acestea fac parte: catalaza, fosfatazele, mucinaza, tripsina, hialuronidaza etc.
Fosfatazele sunt enzime cu rol important in metabolismul glucidelor. Activitatea fosfatazica este mai intensa la masculii care beneficiaza de un regim rational de hranire, ingrijire si exploatare, in timp ce la animalele subalimentate, extenuate etc. activitatea fosfatazelor este mai redusa, desi concentratia spermei variaza in limite normale. Fosfataza acida este secretata in cea mai mare parte de glanda prostata, fiind ca si fructoza, un indiciu al activitatii androgene. Fosfataza alcalina, secretata indeosebi de glandele seminale, intervine in procesul de hidroliza a fructozei.
Mucinaza este o enzima secretata de glandele anexe ale aparatului genital, cu rol de a lichefia mucusul cervical care, in ultimele ore ale caldurilor, este mai vascos, constituind un mediu nefavorabil pentru inaintarea spermilor depusi in conductul genital.
Tripsina este o enzima secretata de glandele anexe, cu actiune mucolitica asupra gelului periovocitar. Se caseste in sperma pasarilor domestice (cu exceptia gansacului), iar la animalele domestice este prezenta numai in sperma de caine. Activitatea tripsinei este asemanatoare hialurinidazei.
Hialuronidaza se formeaza in epiteliul seminifer al testiculului la animalul adult si se gaseste in spermi, lipsind in plasma. Cercetarile efectuate au confirmat ipoteza ca aceasta enzima se afla mai ales in capul spermatozoidului. Hialuronidaza faciliteaza procesul patrunderii spermatozoidului in ovul prin dislocarea celulelor foliculare care formeaza coroana radiata; pentru denudarea ovulului de celulele foliculare este necesar un numar foarte mare de spermi care sa elibereze o cantitate crescuta de hialuronidaza.
Cunoasterea compozitiei chimice a spermei contribuie mult la pregatirea diluantilor care permit mentinerea si prelungirea viabilitatii spermilor in produsul conservat.
Morfologia spermului
Spre deosebire de celelalte celule din organismul animal, spermii sunt celule flagelate, avand atat potenalitate eriditara paterna, cat si proprietatea de a se misca.
Pentru prima data spermii au fost observati in anul 1677 de catre studentul Hamm din Leida, in sperma de om, iar doi ani mai tarziu gametii au fost observati in sperma animalelor, de catre Leuwenhoech.
Celula spermatica la animalele se deosebeste de ovul ca marime, forma si mobilitate. Lungimea spermului este de aproximativ de doua ori mai mica decat diametrul ovulului, iar volumul gametului mascul este de circa 60000 ori mai mic decat cel al gametului femel. Marimea spermilor variaza in limita de 50-80microni. Astfel, la taur si berbec lungimea spermului este de 75-80microni, la tap – 60-65microni, la armasar 50-60microni si la vier – 50-55microni.
Studiul morfologic al spermilor a fost posibil datorita coloratiilor vitale, tehnicilor biochimice si, indeosebi microscopiei electronice.
Sub aspect morfologic spermul este format din: cap, gat, piesa intermediara, piesa principala si piesa terminala. Cele trei piese (intermediara, principala si terminala) alcatuiesc la un loc flagelul sau coada spermului.
Capul spermului la mamifere este ovoid, alungit, aplatizat si usor convex, cu grosimea maxima la baza si ingustat la varf, avand lungimea si latimea de 8-10 microni si respectiv – 4-4,5microni la taur, berbec si vier, 5-7 si respectiv 2,7-4 microni la armasar, caine si cotoi; grosimea spermilor la toate speciile este de 0,1-0,15 microni.
Din punct de vedere al structurilor chimice, capul spermului este format, in special, din nucleoproteide si cantitati mici de proteine libere, lipide si saruri. Nucleoproteidele contin acid dezoxiribonucleic (AND) si o proteina simpla, care, in cazul mamiferelor este o histona, iar in cazul pasarilor – o protamina. Histonele sunt reprezentate de circa 18 aminoacizi, dintre care arginina constituie aproximativ 25%. AND-ul reprezinta circa 55% din substanta uscata a capului spermului, iar impreuna cu histonele – 80-83%. In afara de nucleoproteide capul spermului contine si lipoproteine (17-20%), care sunt concentrate in special, in acrozom.
In componenta capului intra mai multe formatiuni: nucleul, acrozomul, perforatorul, capisonul sau furoul postnuclear, protuberantele bazale, fosa de implantatie si membrana celulara.
Nucleul constituie partea principala a capului spermului. Cromatina nucleara contine acidul dezoxiribonucleic (43%), care reprezinta depozitul codificat al caracterelor ereditare, printre care figureaza si cele de sex.
Partea anterioara a membranei nucleare constituie membrana interna a acrozomului si formeaza corpul acrozomului.
Aproximativ 60% din suprafata nucleului anterior este acoperit de capisonul acrozomului, care are un perete dublu de 0,1 micorni grosime si incorporeaza substanta acrozomala, corpusculii, corpul si vacuolele acrozomale. Restul de 40% din nucleu si membrana nucleara, de la zona ecuatoriala spre baza capului este invelit de furoul nuclear. Prin forma sa, acrozomul constituie la conturarea profilului caracteristic al extremitatii anterioare a capului spermului, pentru fiecare specie in parte.
Perforatorul este o formatiune densa situata intre membrana nucleara si acrozom. I se atribuie rol in perforarea membranei ovulare in timpul fecundatiei.
Protuberantele bazale sunt niste formatiuni semicirculare sau sferice asezate in zona posterioara a capului, in jurul fosei de implantatie, respectiv in jurul insertiei gatului spermului.
Fosa de implantatie este o infundare hemisferica a partii posterioare a nucleului, in care se gaseste implantata extremitatea apicala a filamentului axial al cozii spermului.
Membrana multistrat celulara acopera complet capul, corpul si coada spermului, membrana externa a acrozomului putandu-se detasa spontan in coada epididimului la masculi cu absenta sexuala indelungata; prin ruperea membranei celulare si a membranei externe a invelisului acrozomului in zona ecuatoriala se elibereaza hialuronidaza necesara penetrarii ovulei.
Gatul reprezinta piesa de legatura dintre capul si coada spermului. Este o formatiune dintre capul si coada spermului. este o formatiune foarte scurta dispusa intre centriolul proximal si jumatatea anterioara a centriolului distal. Teaca mitocondriala de 0,1 microni isi afla originea in granulele bazale ale capului, care genereaza o structura mitocondriala dublu spiralata in sensul acelor de ceasornic, care se continua in piesa intermediara pana la inelul terminal Jensen.
In structura piesei intermediare, cu lungimea de 10-15 microni, intra fibrele filamentului axial care sunt dispuse astfel: 2 fibrile centrale, 9 fibrile subtiri care constituie cercul intern si 9 fibrile groase formand cercul extern. Filamentul axial este imbracat de o camasa mitocondriala, dispusa sub forma unui filament spiralat dublu. La exterior se gaseste o membrana bogata in lipide. Aceasta provine din protoplasma celulara, in special din resturile aparatului Golgi, grupate initial la nivelul gatului. Treptat protoplasma se distribuie de-a lungul piesei intermediare; acest proces are loc in timpul tranzitului epididimar si constituie unul din fenomenele importante ale maturarii spermului. In cazul cand nu se produce acesta disperare protoplasma grupata la nivelul gatului sau piesei intermediare, constituie picatura protoplasmatica. Prezenta picaturii protoplasmatice este un indiciu al imaturitatii spermului. Piesa intermediara este constituita in cea mai mare parte din substante lipoproteice. In ea se gasesc grupate majoritatea enzimelor spermului. Piesa intermediara furnizeaza energia necesara proceselor metabolice din spirala mitocondriala.
Piesa principala sau coada propriu-zisa (lunga de 35-45 microni si groasa de 0,4-0,8 microni) este delimitata de inelul lui Jensen, situat la jumatatea externa a centriolului distal, si distal de piesa terminala.
Fibrele din coada spermului, repartizate tot dupa formula 2+9+9 sunt acoperite de un invelis fibrilar spiralat alcatuit dintr-o pereche helicoidala cu mai mult de 400 de infasurari.
Piesa terminala are 3-4 microni lungime si este constituita din portiunea terminala a fibrelor acoperite cu membrana celulara si din care lipseste invelisul spiralat fibrilar al cozii spermului.
Coada spermului contine lipoproteine, proteine simple si lipide (circa 23%). In compozitia lipidelor intra fosfolipide (73,3%), colesterin (14,5%), gliceride (9,6%) si ceara (2,6%). Dintre substantele minerale cele mai importante sunt fosforul, care ocupa 2,7% din substanta uscata a spermului, sodiul, potasiul, calciul, magneziul si sulful.
Miscarea, fenomenul fiziologic caracteristic spermului, este rezultatul contractilitatii fibrelor din filamentul axial. Rolul cel mai important il au fibrele din cercul extern. Se sustine, ca punctul de plecare al contractilitatii se afla in granulele bazale de la nivelul gatului. Energia este furnizata de moleculele mici, care se distrug in procesul de contractilitate si sunt refacute de mitocondriile filamentului axial.
Proprietatile biologice ale spermei
Reusita insamantarilor artificiale este legata de viabilitatea si capacitatea fecundanta a spermei, care, la randul sau, este asigurata de proprietatile biologice ale materialului seminal. Principalele caracteristici biologice ale spermei sunt: mobilitatea aglutinarea si metabolismul spermilor.
Mobilitatea reprezinta una din caracteristicile principale ale spermilor, prin care acestia se deosebesc de celelalte celule ale organismului. Mobilitatea reprezinta un factor indispensabil viabilitatii spermilor.
Mobilitatea si viabilitatea spermilor necesita utilizarea energiei chimice si transformarea ei in energie biologica. Miscarea spermului in baza energiei biologice, se datoreaza portiunii sale terminale, care are o structura similara ciliatelor si flagelatelor. Miscarea gametilor este determinata de contractiile cozii (flagelului) si de rotirea spermului in jurul axei sale longitudinale. Prin contractiile cozii se asigura miscarea de avansare, iar capul, prin forma sa usor exavata (convexa) determina rotirea in jurul axei sale longitudinale. In felul acesta, spermul executa miscarea de «sfredelire si inaintare».
Spermii pot realiza trei feluri de miscari:
de inaintare sau rectiline
circulara sau «in manej»
de pendulare sau vibratoare
Pentru mamifere si pasari miscarea de inaintare este considerata normala, pe cand miscarile circulara si vibratoare sunt anormale.
La aprecierea spermei se tine seama indeosebi de mobilitatea spermilor determinata de viteza cu care acestia inainteaza in campul microscopic, precum si de procentul de spermi capabili sa execute aceasta miscare.
Viteza de inaintare a spermiilor variaza in functie de specie, de intervalul de timp cand se examineaza sperma dupa recoltare, de pH-ul spermei de temperatura mediului ambiant etc. pe specii, viteza medie de inaintare pe minut este urmatoarea: la armasar – 5,22 mm, la taur – 4,02 mm, la berbec – 3 mm, la caine – 2,08 mm. Aceste date sunt posibile la un pH al spermei caracteristic spermei si la temperatura obisnuita a organismului animal (37-38(C).
Aglutinarea spermilor consta in alipirea sau incleierea acestora, sub forma de rozeta sau dezordonata ca urmare a diminuarii sau pierderii totale a sarcinii electrice negative. Aglutinarea este reversibila, in cazul cand spermii se reunesc in forma de rozeta, alipindu-se numai de capul, iar mobilitatea cozii este pastrata si ireversibila, cand gametii se alipesc de toata suprafata celulara si raman imobilizati (aglutinare dezordonata sau totala).
Scaderea sau absenta sarcinii electrice negative are loc la aparitia in sperma a particulelor incarcate cu sarcina electrica pozitiva. Aglutinarea spermilor se produce mai ales la cresterea concentratiei ionilor de hidrogen ca urmare a acumularii in mediu a acidului lactic. Astfel, intr-un mediu cu aciditate scazuta (pH 5-6,4) spermii se aduna sub forma de rozeta, iar cand aciditatea este mai mare se produce aglutinarea dezordonata (totala) a spermilor si acestea nu mai fac miscari. Aglutinarea spermilor apare usor in prezenta ionilor metalelor polivalente, precum si sub actiunea aglutininelor spermatice, prezente in materialul seminal si in vaginul femelei. Formarea aglutininelor spermatice este reactia organismului femel la patrunderea parenterala a proteinelor spermatice. Prin urmare, la femelele tinere, nulipare aglutininele lipsesc sau sunt intr-o cantitate mica, pe cand la femelele insamantate si mai ales la cele multipare aglutininele sunt in cantitati mari. Posibilitatea aglutinarii spermilor trebuie luata in considerare si la utilizarea diluantilor lapte-ou sau la adaugarea in diluanti a plasmei sanguine.
Aglutinarea spermilor poate fi prevenita prin reactia de antiaglutinare. In conditii naturale, in conductul genital femel aglutinarea spermilor este prevenita de antiaglutininele, care se contin in lichidul folicular al ovarului si in sperma masculului (in secretia prostatica). Datorita acestor particularitati aglutinarea spermilor la animalele sanatoase se inregistreaza rar.
Metabolismul
Reprezinta procesul biologic fundamental prin care se asigura energia necesara mobilitatii si viabilitatii spermilor. Substantele energetice se gasesc in spermi sau in plasma seminala, ceea ce demonstreaza existenta a doua surse energetice. Astfel, s-a demonstrat ca produsele metabolice se produc atat la nivelul spermilor, cat si in plasma seminala. Spermii pot utiliza energia chimica necesara mobilitatii si viabilitatii in mediul anaerob, dar si in cel aerob.
Metabolismul in mediul aerob. La baza metabolismului aerob sta mecanismul glicolitic. El se caracterizeaza prin activitate respiratorie intensa insotita de diminuarea progresiva a fructozei si aparitia in sperma a acidului lactic. In mediul aerob spermii folosesc ca substrat energetic glucidele si in primul rand, fructoza. Ca rezultat al metabolismului apare acidul lactic. O parte din fructoza este oxidata pana la stadiul de CO2 si H2O. Rezulta ca in conditii de aerobioza spermii manifesta si activitate respiratorie (consum de oxigen), a carei intensitate depinde in mare masura de concentratia spermei. Astfel, volumul de oxigen (mm3) consumat in decurs de o ora la temperatura de 20(C de catre 100 milioane de spermi variaza in functie de specie:
La taur – 3,4
La berbec – 8,4
La armasar – 4,3
La vier – 7,2
Coborarea temperaturii spermei pana la 10(C reduce intensitatea activitatii respiratorii de 2 ori. La temperatura de 0(C activitatea respiratorie a spermilor se manifesta foarte slab. Cresterea aciditatii mediului inhiba respiratia, iar alcalinizarea mediului o intensifica.
Spermii usor oxideaza si sorbitolul, secretat de glandele seminale. Acesta serveste, de asemenea, ca sursa energetica pentru spermi. In anumite cantitati sorbitolul in spermi se formeaza din fructoza si glucoza. Deoarece fructoza se contine in cantitati mai mari in sperma rumegatoarelor si cantitatea de sorbitol este mai mare in sperma acestor reproducatori: la taur – 10-136 mg%, la berbec – 26-120 mg%, la vier – 6-18 mg% si la armasar 20-60 mg%.
Activitatea respiratorie la spermi se produce datorita enzimelor in special sub influenta citocromoxidazei. In prezent in sperma a fost descoperit intregul complex de fermenti oxidanti. Cantitatea enzimelor din sperma variaza in functie de specie: cantitatea enzimelor din sperma de armasar si vier este de cateva ori mai mare decat din sperma rumegatoarelor.
De obicei, in procesul de metabolism, spermii folosesc substantele energetice (zaharurile) care se gasesc in plasma seminala; in cazul epuizarii rezervelor din sperma, gametii folosesc fosfolipidele care constituie principala sursa de energie intracelulara. Mai mult se utilizeaza fosfolipidele din sperma berbecului, probabil de aceea ca in sperma acestuia rezervele de zahar se epuizeaza in 3-6 ore.
Etapele mecanismului fosfolipidic decurg dupa urmatoarea schema generala:
degradarea hidrolitica a fosfolipidelor;
oxidarea acizilor grasi.
Acest tip de metabolism in care se folosesc numai substante energetice intracelulare, denumit si metabolism endogen, nu este insotit de formarea acidului lactic.
Spermii sunt celule care fac parte din anaerobii facultativi, adica gametii se pot misca atat in conditii de aerobioza, cat si in conditii de anaerobioza.
In sperma masculilor de tip vaginal de insamantare naturala (taur, berbec) se contin cantitati importante de zaharuri (pana la 1500 mg%), pe cand in sperma reproducatorilor de tip uterin de monta naturala se evidentiaza numai urme de zahar, de aceea spermii la aceste specii nu sunt capabili, sau manifesta o capacitate slaba de glicoliza.
Metabolismul in mediul anaerob. In conditii de anaerobioza, substratul energetic al spermilor este preluat numai din mediul ambiant, adica din plasma seminala. Ca si in mediul aerob, spermii folosesc ca substrat energetic monozaharidele: fructoza, glucoza si manoza, rolul cel mai important avandu-l fructoza. Intre glicoliza aeroba si anaeroba exista urmatoarea deosebire esentiala: in glicoliza aeroba o parte din acidul lactic rezultat prin descompunerea monozaharidului este oxidata mai departe pana la obtinerea de H2O si CO2, constituind prin aceasta o sursa de energie suplimentara, care duce la scaderea consumului de monozaharide; in glicoliza anaeroba acidul lactic, care constituie produsul final al glicolizei, nu mai sufera in continuare procesul de oxidare.
In sperma animalelor domestice, eliberarea de energie se face pe baza proceselor oxidative si glicolitice. La taur, berbec si tap, fiindca sperma este bogata in glucide si saraca in electroliti, au loc ambele procese (de intensitate egala). La armasar, vier si caine, specii la care sperma este saraca in glucide si bogata in electroliti, predomina procesele oxidative.
Intensitatea mecanismului glucolitic este mai mare la un pH de 7,6; in cazul acidularii mediului pana la pH 6,4 sau la alcalinizarea acestuia procesul de glicoliza slabeste.
Principalul glucid din sperma este fructoza. Secretata in cea mai mare parte de glandele seminale ea constituie sursa principala de energie pentru spermi. De aceea, in spermii, care se gasesc in canalele si epididimul testicular procesul de fructoliza nu are loc.
La adaugarea in sperma a glucozei coeficientul de respiratie creste, ceea ce denota intensificarea utilizarii zaharului de catre spermi. Spermul este o celula cu permeabilitate ridicata si permite trecerea din plasma a zaharului, de aceea includerea in compozitia mediilor de dilutie a zaharurilor prelungeste viabilitatea gametilor, prevenind totodata epuizarea rezervelor energetice proprii. Prin membrana celulara a spermului usor trece glucoza sau fructoza, mai greu trec dizaharidele si este impermebila pentru zaharuri fosforilate.
Din problemele complicate ale metabolismului spermilor, pentru aplicarea practica a insamantarilor artificiale este important ca gametii mamiferelor in mediul ambiant sunt capabili sa consume oxigen si glucoza, iar in cazul prezentei zaharului acestea pot trai si se misca si fara oxigen. Astfel, in conditii de anaerobioza spermii traiesc mai mult decat in prezenta oxigenului. Pe aceasta capacitate a spermilor se bazeaza metoda de pastrare a spermei sub un strat de ulei de vazelina, care limiteaza aeratia, iar prin urmare si procesele de oxidare.
Odata cu acumularea acidului lactic spermii trec intr-o stare de anabioza; la alcalinizarea mediului si ridicarea temperaturii mobilitatea gametilor se restabileste. Anabioza acida poate fi folosita la conservarea spermei. Trecerea spermilor in stari de anabioza permite marirea termenului de pastrare a spermei in afara organismului pana la cateva zile.
Prin incalzire sau alcalinizarea mediului spermii se scot din starea de anabioza.
Dupa cum am mentionat mai sus, una din caracteristicile principale ale spermilor este mobilitatea, adica capacitatea de a se misca activ pe baza energiei provenita din mecanismul glicolitic si activitatea respiratorie. Pentru a se misca, spermii necesita acid adenozin-trifosforic (ATP). Sperma taurilor fertili contine 7-11 mg% de ATP. Scaderea nivelului de ATP pana la 3 mg% reduce fecunditatea spermilor. Prin procesele de fructoliza are loc transformarea fructozei ce duce la aparitia unei importante cantitati de energie chimica. Aceasta se acumuleaza sub forma de ATP, care ulterior, prin desfacerea legaturilor macroergice, furnizeaza energie pentru contractarea cozii spermului. In coada spermului a fost pusa in evidenta spermozina, analog al actomiozinei din muschi. Sub actiunea spermozinei, care are proprietati enzimatice se desfac legaturile macroergice ale ATP, din care apar acidul adenozin-difosforic si acidul fosforic; in rezultatul acestui proces spermii sunt asigurati cu energie. Activitatea enzimatica a spermozinei este optima la nivelul pH-ului de 8,3, de aceea, alcalinizarea spermei intensifica mobilitatea spermilor. Adaosul de ATP in sperma nu modifica mobilitatea spermilor deoarece membrana celulei spermatice nu lasa sa treaca acidul adenozin-trifosforic. Glucoza, adaugata la sperma, amelioreaza procesul de glicoliza, iar prin urmare, si activitatea respiratorie a spermilor, mentinandu-se astfel mobilitatea lor.
Raportul dintre intensitatea proceselor de glicoliza si activitatea respiratorie a spermilor la animalele domestice determina doua tipuri de sperma:
Sperma care contine cantitati mai mari de zaharuri si slab asigurata cu enzime cito-respiratorii. Spermii sunt capabili de glicoliza si activitate respiratorie in masuri egale. Asa tip de spermi este caracteristic pentru tauri, berbeci si tapi;
Sperma care contine doar urme de zahar, in schimb este bine asigurata cu fermenti cito-respiratori. Predomina procesele de activitate respiratorie; datorita continutului redus de zaharuri se cheltuie in scopuri energetice, cu preponderenta lipidele. Este caracteristica armasarilor, vierului si cainelui.
Actiunea asupra spermilor a factorilor de mediu
Deoarece o mare varietate de factori fizico-chimici si biologici afecteaza grav viabilitatea spermilor, la prelevare si prelucrarea materialului seminal trebuie sa se cunoasca actiunea asupra gametilor a diferitor factori de mediu, cum ar fi: temperatura, lumina, presiunea osmotica, reactia mediului, flora bacteriana etc.
Temperatura. Viabilitatea si mobilitatea optima a spermiilor se mentine o anumita perioada de timp la temperatura fiziologica, de 37-38(C. Ridicarea temperaturii pana la 40(C asigura activizarea mobilitatii gametilor, insa brusc se reduce termenul de viabilitate al spermilor. La temperatura de 45(C gametii mor datorita coagularii proteinelor spermatice.
Coborarea treptata a temperaturii reduce activitatea cinetica a celulelor spermatice, deoarece are loc inhibarea (diminuarea) proceselor de respiratie si glicoliza. La temperatura de 15(C miscarea spermiilor devine vibratorie, iar dupa racirea pana la +5(C miscarea gametilor inceteaza – apare anabioza termica a spermiilor. Exista o relatie invers proportionala intre temperatura si termenul de pastrare a viabilitatii spermiilor. Racirea spermei intr-un interval de timp scurt, precum si trecerea brusca de la temperaturi ridicate la temperaturi coborate provoaca la spermi socul termic (frigorific), exprimat prin pierderea capacitatii fecundative de catre gameti, aparitia formelor teratologice de spermi si chiar moartea acestora.
Exista mai multe teorii si ipoteze referitoare la producerea socului termic, insa nici una nu elucideaza complet mecanismul aparitiei acestuia. Se considera ca un rol important in acest sens il au procesele de osmoza si difuzie din sperma. Cu cat aceste procese decurg mai lent, cu atat manifestarile socului sunt mai atenuate.
Socul termic se manifesta deja la temperatura de +25-20(C, insa spermii sunt mai sensibili fata de acest fenoment la racirea spermei proaspat recoltata mai jos de +18(C. De aceea, in sala de recoltari si in laboratorul unde se lucreaza cu sperma, temperatura nu trebuie sa fie sub limita de +18(C.
Posibilitatea aparitiei socului termic trebuie luata in seama mai ales la prelucrarea spermei de taur si berbec, care datorita volumului mic al ejaculatului, se raceste mai repede.
In practica insamantarilor artificiale, pentru atenuarea socului termic se foloseste galbenusul de ou de gaina. Lecitina, continuta in galbenus, se absoarbe la suprafata gametilor si formeaza o pelicula, care protejeaza membrana celulara a spermiului si il face sa reziste la actiunea socanta a frigului. Alta metoda de prevenire a socului termic este coborarea treptata a temperaturii pana la +4-2(C, care face posibila adaptarea spermiilor la regimul de temperatura dat.
Punerea spermiilor in conditii de anabioza, prin crearea unor temperaturi scazute, sta la baza conservarii materialului seminal prin refrigerare sau congelare. Dupa reanimare, prin ridicarea temperaturii, gametii isi restabilesc mobilitatea si capacitatea fecundanta.
Lumina. Razele solare directe omoara spermii in timp de 20-40 minute. Lumina difuza nu influenteaza viabilitatea gametilor. Prin urmare, la prelevarea si procesarea materialului seminal se evita actiunea asupra ejaculatelor, a razelor solare directe.
Reactia mediului. Este proprietatea fizico-chimica a spermei care reprezinta gradul de aciditate sau concentratia ei in ioni de hidrogen. Intre pH-ul spermei, concentratie si metabolism exista o stransa corelatie. Astfel in sperma deasa de berbec si taur pH-ul are tendinta de aciditate (6,6-6,9), ca rezultat al metabolismului cumulat in acid lactic al spermiilor, in timp ce la sperma rara de armasar si vier pH-ul este usor alcalin (7,0-7,9), din cauza numarului redus de gameti care elibereaza mai putin acid lactic.
Glucoza este considerata ca sursa principala de energie a spermiilor atat in mediul aerob cat si in cel anaerob; la sperma cu o concentratie ridicata in fructoza se constata diminuarea intr-un timp foarte scurt al pH-ului dat de acumularea acidului lactic: la valoarea pH-ului de 6,3-6,4 apare anabioza acida a spermiilor. Acest principiu este pus la baza conservarii spermiilor. Acest principiu este pus la baza conservarii spermei la temperatura camerei (+16-18(C) si in medii usor acide (prin barbotarea mediilor cu CO2).
Cresterea in continuare a aciditatii (pHDeplasarea pH-ului in sensul alcalinizarii, initial activizeaza mobilitatea gametilor, iar mai tarziu acestea mor.
Carbonatii, fosfatii si citratii sunt elementele care formeaza sistemul tampon al spermei, datorita caruia gametii sunt capabili sa reziste o anumita perioada de timp la modificarile pH-ului.
Presiunea osmotica. Presiunea osmotica a spermei este constanta si se apropie de cea a sangelui. Plasma seminala este izotonica cu aceea a spermiului, intrucat presiunea osmotica a ei este egala cu presiunea osmotica din interiorul gametului.
Spermii sunt foarte sensibili fata de modificarile presiunii osmotice, adica fata de concentratiile substantelor din lichidul in care se gasesc. De aceea, este necesar sa se tina seama la stabilirea mediilor de dilutie, intrucat modificarea acestora spre hipotonie sau spre hipertonie, fata de presiunea osmotica a plasmei seminale, duce la micsorarea viabilitatii si la moartea spermiilor.
Indiferent de situatie, se impune ca diluantii pentru conservarea spermei sa fie izotonici cu spermii si ca acestea sa nu vina in contact cu apa.
Pentru sperma sunt izotonice solutiile de clorura de sodiu de 1%, bicarbonat de sodiu de 1%, citratul de sodiu de 3%, glucoza de 6,4% etc.
Flora microbiana. Exista o corelatie directa intre gradul de contaminare a spermei cu microbi si fungi, calitatea materialului seminal si fecunditatea (rata conceptiei) la animale. In conditii naturale, la reproducatorii sanatosi, in tubii seminiferi, canalul epididimar, canalul deferent si portiunea incipienta a uretrei microorganismele lipsesc. Insa, datorita contactului pe care sperma o are, in timpul ejacularii cu diferite segmente ale aparatului urogenital sau cu diferite aparate si instrumente in timpul examinarii si prelucrarii, la care se poate adauga influenta atmosferei salilor de recoltare, este imposibil de a se obtine un material seminal steril.
Stabilirea celor mai importante locuri la nivelul carora sperma poate fi poluata microbian creeaza posibilitati reale pentru limitarea infectarii materialului seminal cu germeni patogeni sau conditionat patogeni. Aceasta actiune, la care se adauga si aseptizarea realizata prin diferite antibiotice si sulfamide ce se introduc in diluantii pentru sperma, are repercusiuni directe asupra pastrarii viabilitatii spermiilor in conditiile conservarii indelungate.
In general, sursele de contaminare ale spermei pot fi externe si interne.
Mediul inconjurator, in care se efectueaza recoltarea si prelucrarea spermei, reprezinta una din cele mai importante surse de contaminare. Cele mai frecvente surse externe sunt: atmosfera din adaposturile reproducatorilor, salile de recoltare si laboratoarele, precum si instrumentele cu care se recolteaza si se efectueaza examinarea si prelucrarea spermei.
Numarul de germeni din adaposturile pentru reproducatori variaza mult, in functie de o serie de factori: curenti de aer, miscarea animalelor, umiditate, felul asternului. In general, numarul de microorganisme din adaposturile de taurine este intre 120 si 2500/m3 de arer. In conditii de igiena necorespunzatoare numarul microbilor atinge 1,6milioane/m3.
Sursele interne de contaminare a materialului seminal isi au originea mai ales la nivelul organelor aparatului genital. Astfel, flora bacteriana nepatogena si patogena, specifica si nespecifica din sperma reflecta gradul de contaminare a aparatului genital.
Caile de contaminare a organelor genitale si deci a spermei pot fi:
calea hematogena – principala in contaminarea cu leptospire sau cu Brucella;
calea canaliculara – principala cale de contaminare a glandelor anexe, a epididimului si uneori chiar a testiculelor.
Furoul poate fi sursa importanta de infectie ascendenta, mai ales la vier, datorita particularitatilor anatomice ale acestuia.
Dintre germenii nepatogeni in sperma se identifica Streptococi, diplococi, stafilococi etc. Daca rezistenta animalului scade, germenii pot deveni patogeni.
Germenii patogeni nespecifici din sperma sunt E. coli, Corynebacterium piogenes, Pseudomonas, Stafilococus piogenes, germenii din genul Proteus. Germenii din genul Proteus, E. coli si Pseudomonas, in asociatie cu stafilococul piogen, determina o proportie ridicata de anomalii morfologice si scaderea capacitatii fecundante a spermei; pe langa importante modificari enzimatice, acestea pot infecta si femelele, prin insamantari artificiale.
Germenii din flora bacteriana specifica prezinta un tropism particular pentru aparatul genital mascul, in aceasta grupa fiind incadrati Brucella abortus, Vibrio foetus, Trichomonas foetus, Listeria monocytogenes, uneori si Mycobacterium tuberculosis. Insamantarea femelelor cu astfel de sperma contaminata conduce la aparitia infectiilor genitale.
Deseori in sperma sunt descoperiti fungi patogeni (Candida albicans, Aspergillus, Apsidia, Mucor etc.) care favorizeaza aparitia endometritelor, iar in cazul instalarii gestatiei pot provoca moartea produsilor conceptionali.
Actiunea substantelor chimice. Majoritatea substantelor chimice sunt toxice pentru spermi. Dintre substantele neorganice mai toxice sunt sarurile si oxizii metalelor grele (mercur, plumb) care blocheaza sistemele enzimatice ale gametilor. Sunt periculosi pentru spermi de asemenea si oxizii zincului, aluminiului, ferului, cuprului etc., de aceea in practica insamantarilor artificiale se folosesc instrumente nichelate sau confectionate din sticla si material plastic, iar sticlaria – din sticla neutra.
Vaporii de creolina, lizol, terebentina, eter, xeroform, iodoform s. a. au o actiune nociva asupra spermiilor chiar de la distanta. Trebuie de luat in seama, de asemenea, actiunea nefavorabila asupra spermiilor a fumului de tutun, a parfumului, precum si a mirosului de ceapa si usturoi.
O actiune foarte toxica asupra gametilor exercita detergentii, acizii neorganici, un sir de acizi organici si oxidantii.
Mai putin toxice pentru spermi sunt nitrofuranele. Sulfamidele si antibioticele au o actiune relativ inofensiva asupra spermiilor, de aceea in cantitati admisibile se adauga in mediile de dilutie pentru sperma.
Necatand ca in practica insamantarilor artificiale este contraindicata aplicarea remediilor dezinfectante, totusi pentru dezinfectia instrumentelor se folosesc substante de acest fel. Mai bine venit in acest sens s-a dovedit a fi alcoolul etilic. Spre deosebire de alte substante dezinfectante, acesta repede se evapora si se dizolva bine in apa. Cu alcool de 70% se dezinfecteaza utilajul, dispozitivele pentru recoltarea spermei, precum si instrumentarul pentru insamantarea artificiala.
Ramasitele de alcool ramase pe instrumentar dupa dezinfectie se inlatura cu un tampon de vata imbibat in solutie de clorura de sodiu de 1%.
Bazele stiintifice ale recoltarii spermei de la masculi
Activitatea de reproducere la masculi este generata de reflexele sexuale: de apropiere, erectie, salt si imbratisare, intromisiune si ejaculare. Modul de manifestare a reflexelor sexuale are un rol important in desfasurarea proceselor de reproducere.
Evolutia normala a reflexelor sexuale are ca urmare eliminarea unei sperme in cantitate normala si de calitate superioara. Dereglarea sau excluderea unuia din reflexele sexuale are drept consecinta imposibilitatea manifestarii celorlalte reflexe sau elaborarea unei sperme calitativ inferioare si in cantitate mai mica.
Reflexele sexuale, dupa cum se stie, fac parte din grupa reflexelor innascute sau neconditionate. Desfasurarea lor, deci actul sexual in totalitate, se produce sub influenta sistemului neuroendocrin. O contributie importanta in reglarea normala a proceselor reproductive o au hormonii sexuali, care mentin reactivitatea sistemului nervos si stabilesc un anumit grad de excitabilitate.
In timpul vietii animalului, peste reflexele neconditionate se suprapun reflexele conditionate sau dobandite. Ele se formeaza sub influenta conditiilor de viata ale reproducatorului (alimentatie, intretinere, exploatare), le intaresc pe cele neconditionate si asigura labilitatea comportamentului sexual al masculului, adica adaptarea celui din urma la noile conditii de reproductie.
In centrele de insamantare artificiala, la o activitate sexuala desfasurata in conditii favorabile are loc formarea si consolidarea reflexelor sexuale pozitive, pe cand nerespectarea sistematica a conditiilor in timpul prelevarii spermei (existenta de zgomote, prezenta unor persoane straine, schimbarea tehnicianului recoltator si a locului unde se face recoltarea) determina suprapunerea reflexelor conditionate negative, care fac dificila recoltarea materialului seminal.
La masculii animalelor agricole si mai ales la tauri si vieri usor se formeaza si se intaresc reflexe sexuale conditionate prin prezenta unor femele care nu sunt in calduri, unor masculi si chiar unor manechine care nu se aseamana neaparat cu femelele din specia respectiva.
Diferentierea neinsemnata in comportamentul sexual al masculilor si in special nespecificitatea reflexului de salt si imbratisare precum si crearea unor conditii similare cu cele din timpul intromisiunii fac posibila recoltarea spermei de la reproducatori; prin urmare la baza prelevarii spermei de la masculi sta formarea si intarirea reflexelor conditionate pozitive.
Principii si metode de recoltare a spermei
Prelevarea spermei consta in provocarea artificiala a ejacularii, fara a avea loc actul sexual intre mascul si femela. Fiind o operatiune foarte importanta, multi cercetatori au cautat sa amelioreze metodele de colectare a spermei, fara sa prejudicieze sanatatea masculului. In afara de aceasta, metodele de recoltare a spermei trebuie sa asigure colectarea ejaculatului fara pierderi, fara afectarea spermilor, precum si asigurarea unei calitati sanitare inalte a materialului seminal.
Metodele existente de recoltare a spermei de la reproducatori se impart in:
metode uretrale, ce permit obtinerea spermei nemijlocit din uretra masculului;
metode vaginale, care tin de colectarea spermei din vaginul femelei dupa actul montei.
Metodele uretrale de recoltare a spermei
Recoltarea spermei cu vaginul artificial
In prezent este cea mai raspandita forma pentru recoltarea spermei de la reproducatorii animalelor agricole. Vaginul artificial pentru prima data a fost inventat de cercetatorul italian Giuseppe Amantea (1914), iar ulterior a suferit modificari si imbunatatiri in vederea adaptarii lui pentru recoltarea spermei la toate speciile (Walton, Ivanov, Milovanov, Comisarov, Lipatov, Rodin).
Principiul recoltarii spermei cu vaginul artificial consta in asigurarea conditiilor existente in vaginul natural al femelei in calduri: temperatura, presiune, lubrifiere.
Vaginul artificial este alcatuit din urmatoarele parti:
un tub cilindric rigid sau semirigid confectionat din cauciuc (taur, vier), ebonita (berbec) sau tabla (armasar);
o camasa subtire de cauciuc;
un pahar colector.
Tubul vaginal pe lungimea lui prezinta un orificiu astupat cu un dop sau un robinet de ebonita si un maner pentru fixarea vaginului in timpul recoltarii (la armasar).
In vaginul artificial pentru tauri se folosesc pahare colectoare din sticla cu peretii dubli sau colectoare de o singura intrebuintare, confectionate din polietilena, in forma de con.
In vaginul artificial pentru berbeci se folosesc pahare colectoare din sticla cu peretii dubli sau simpli. Paharele colectoare cu peretii dubli, la un capat au o depresiune in forma de con, pentru sperma, iar la capatul opus au o adancitura in forma de palnie, cu un orificiu pentru a turna apa calda in spatiul dintre pereti: 50ml in paharul colector pentru vaginul berbecului si 100ml pentru vaginul taurului. Temperatura apei turnate trebuie sa fie de 35-40(C, iar in paharul colector, in momentul recoltarii spermei, dupa incalzirea peretilor lui, de 30-35(C. Dupa umplerea paharului colector cu apa. Orificiul se astupa cu un dop de cauciuc.
Paharele colectoare cu peretii dubli protejeaza sperma de racirea brusca si sunt folosite cand temperatura este mai joasa de +18(C.
In calitate de pahar colector in vaginul artificial pentru vieri se foloseste un borcan de sticla de 500-1000ml. In borcan se monteaza un filtru de masa plastica pentru filtrarea secretului glandelor bulbo-uretrale.
Paharul colector pentru vaginul artificial al armasarilor este confectionat din cauciuc.
Pregatirea vaginului artificial
Asamblarea vaginului se face prin introducerea camasii vaginale in lumenul tubului vaginal si rasfrangerea ei peste capetele acestuia. Intre cele doua componente se creeaza astfel un spatiu care este umplut cu apa calda si aer (la unele specii). Pentru fixarea camasii se folosesc inele de cauciuc la ambele capete.
Camasa vaginului trebuie moderat intensa in asa fel, incat sa se creeze cute longitudinale. Cutele helicoidale impiedica intromisiunea si desfasurarea corecta a reflexelor sexuale.
Spalarea si dezinfectarea vaginului se face cu ajutorul unor perii cu coada lunga, cu apa calduta, in care se poate adauga o cantitate mica de bicarbonat de sodiu (2-3%), se clatesc cu apa curgatoare. Sterilizarea vaginului se face, apoi prin autoclavare. In centrele de reproductie fiecare reproducator are doua vagine artificiale, care dupa sterilizare se pastreaza in dulapuri-termostate la temperatura de 42(C, urmand sa se pregateasca inainte de recoltare.
Prin orificiul din peretele tubului vaginal se introduce apa calda in asa fel, incat in timpul recoltarii temperatura interioara in vaginul artificial sa fie de 40-42(C.
Cantitatea de apa turnata in vagin si temperatura ei la diferite specii de reproducatori
Reproducatorul
Modelul vaginului
Cantitatea de apa, ml
Temperatura apei, (C
Taur
Scurt, de cauciuc
300
60-65
Berbec
De ebonita
150-180
50-55
Vier
De cauciuc
300-400
60-65
Armasar
De tabla
1500-1800
50-60
Presiunea este creata de apa calda si de aerul care se introduce printr-un dispozitiv din ebonita, de forma unui robinet atasat la dopul vaginului.
Lubrifierea camasii vaginale, prin care se imita mucusul estral, se realizeaza prin ungerea acesteia cu diluant steril pentru sperma. La unul din capetele vaginului artificial se ataseaza paharul colector, care la taur se fixeaza cu un inel de siguranta, pentru a nu fi azvarlit in timpul recoltarii.
Este strict necesar ca recoltarea spermei cu vaginul artificial sa se faca in conditii igienice, pentru a se evita contaminarea materialului seminal cu diferiti agenti infectiosi si parazitari.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial se face fie pe femele in calduri, fie pe femele care nu sunt in calduri, pe alti masculi fie pe manechine. Operatia de prelevare se efectueaza in sala de recoltare.
Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente. La tauri, inainte de recoltarea spermei, perii de pe furou se tund. Fara contactul prealabil al taurului cu vaca, recoltarea spermei este imposibila. De aceea taurul este contactat cu femela pentru excitatia sexuala, sub actiunea careia sperma din epididimul testicular se deplaseaza in ampulele canalelor deferente. Ulterior, mana lubrefiata se introduce in intestinul rect, se pipaie gatul vezicii urinare si ampulele canalelor deferente, amplasate anterior de glandele seminale. In urma miscarilor de netezire a dilatarilor ampulare si a glandelor anexe are lor ejacularea.
Recoltarea spermei prin fistula uretrala prezinta interes teoretic si practic. Metoda este practicata mai mult la armasari si permite recoltarea unei sperme absolut sterile cu un potential inalt de fecunditate. Reproducatorii cu fistule uretrale pot fi utilizati in reproductie timp indelungat.
Pentru recoltarea spermei prin fistula se executa uretrostomia perineala. Operatia se face in asa fel, incat capatul interior al fistulei sa se situeze la nivelul planseului bazinului, intre tuberozitatile sciatice. La cateva zile dupa operatie armasarii se adapteaza la conditiile noi; pentru actul mictiunii ei accepta poza caracteristica iepelor, in asa fel incat nu-si uda membrele cu urina. La trei-patru saptamani dupa operatie reproducatorul poate fi folosit pentru recoltarea spermei.
Inainte de recoltarea spermei baza cozii se infasoara cu o banda de tifon, iar marginile fistulei se prelucreaza cu un tampon imbibat cu o solutie de acid boric, ser fiziologic de clorura de sodiu sau cu alcool de 50-60%. In momentul saltului armasarului pe iapa in calduri, coada masculului se da intr-o parte, iar la fistula se ataseaza un vas steril. In urma ejacularii sperma se acumuleaza in vasul alaturat.
Recoltarea spermei prin masturbatie a fost aplicata pentru prima data de catre Spallanzani, la caine. Ejacularea se produce in urma presiunii mecanice asupra penisului. Prin acest procedeu se poate recolta sperma de la caine si vier. Se executa cu degetele, prin traversul furoului, masaje, mai ales la extremitatea penisului, unde se gasesc mai multe terminatii nervoase. Penisul intra in erectie, si dupa 10-12 min. masculul ejaculeaza.
Recoltarea spermei prin masaj abdominal da rezultate bune la cocosi. Pentru reusita operatiei, cocosul este contentionat de un ajutor, intr-o pozitie convenabila. Se efectueaza cu degetul mare si cel aratator de la mana dreapta un masaj sub forma unor compresiuni, in sens cranio-caudal de la stern pana la regiunea ischio-pubiana. Cu degetele corespunzatoare de la mana stanga operatorul apasa din cand in cand pe peretii cloacei.
Recoltarea spermei cu aparatul electro-ejaculator. Metoda se bazeaza pe excitatiile produse de curentul electric asupra centrului ejaculator din maduva lombara, in urma careia se produc contractii ale musculaturii netede din peretii cailor spermatice si are loc ejacularea. Electro-ejacularea se poate aplica la berbec, taur si pasari.
Metodele vaginale de recoltare a spermei
Recoltarea spermei cu ajutorul buretului. Metoda era folosita in primii ani de stabilire a insamantarilor artificiale, la recoltarea spermei de la tauri, berbeci si armasari. Esenta metodei consta in folosirea unui burete, care, dupa o prelucrare respectiva, se introduce in vaginul unei femele in calduri, dupa ce se admite actul montei. Dupa ejaculare buretele se extrage din vagin si se scurge sub o presa speciala. Metoda folosirii buretelui la recoltarea spermei are urmatoarele neajunsuri:
buretele, ca corp strain, poate sa deregleze dinamica ejacularii, determinand inhibitia reflexelor sexuale si, in cele din urma, diminuarea volumului ejaculatului;
tehnica pregatirii buretelui este complicata; pentru aceste scopuri este necesara o prelucrare speciala;
in urma presarii buretelui, multi spermi se traumeaza;
buretele introdus in vagin absoarbe cantitati considerabile de mucus vaginal care influenteaza negativ viabilitatea spermilor.
Metoda recoltarii spermei cu speculumul vaginal
Sperma se aspira din vaginul femelei dupa actul montei cu ajutorul speculumului vaginal si seringii. Aceasta metoda se aplica la vaci, oi si iepe; la cabaline colectarea spermei este posibila numai cand canalul cervical este inchis.
Metoda vaginala de recoltare a spermei este simpla, insa nu si lipsita de neajunsuri:
o parte din sperma se pierde printre pliurile mucoasei vaginale;
ejaculatul se amesteca cu mucus vaginal, care reduce calitatea materialului seminal.
Multe din metodele de recoltare a spermei descrise mai sus, cum sunt prelevarea cu ajutorul buretelui, cu speculumul vaginal, prin fistula etc. au astazi mai mult o valoare istorica si se folosesc in mod exceptional in cazul in care procedeele curente de recoltare nu dau rezultate.
In prezent, la majoritatea speciilor de animale, recoltarea spermei se realizeaza cu ajutorul vaginului artificial. In afara de aceasta metoda se mai folosesc: electroejacularea (la berbec, taur, caine, pasari); masajul abdominal (la pasari); masajul ampulelor canalelor deferente si al glandelor seminale (la taur); masturbatia (la vier si caine).
Particularitati de recoltare, pe specii
Recoltarea spermei la taur
Pentru recoltarea spermei la taur se pot folosi trei metode:
vaginul artificial;
electroejacularea;
masajul ampulelor canalelor deferente si alveziculelor seminale.
Metoda vaginului artificial
Aceasta tehnica de recoltare permite obtinerea unui ejaculat concentrat, nepoluat, cu insusiri asemanatoare celui natural si fara a necesita un personal de calificare inalta sau precautie deosebita in manipularea taurilor.
Prelevarea spermei se efectueaza in sala de recoltare, special amenajata, dupa doua ore de la hranire si adapare. Vaginul pentru recoltarea spermei la taur este adaptat in functie de marimea penisului si este individual pentru fiecare reproducator.
In ultimul timp se utilizeaza dispozitive cu dimensiuni mai reduse, de 30 cm lungime pentru masculii adulti si de 26 cm pentru taurii tineri. Ejacularea se realizeaza in paharul colector de o singura intrebuintare de forma tronconica, din polietilena, protejat termic.
La taurine, declansarea reflexului ejacularii depinde in principal de asigurarea factorului temperatura.
Stimularea sexuala a taurilor inainte de recoltare se realizeaza prin plimbarea acestora «in cerc» in apropierea salii de recoltare, retinerea masculilor cateva momente inaintea saltului, efectuarea unui sau a doua salturi in gol pentru donatorii mai putin pregatiti, sau schimbarea taurilor manechini. In absenta libidoului se indica palparea transrectala a aparatului genital sau prezenta unei femele in calduri; saltul acesteia pe mascul reprezinta pentru el un stimul sexual foarte puternic.
Electroejacularea se aplica la taurii tineri, la care recoltarea se face cu usurinta, la masculii cu un libidou scazut sau la cei cu impotenta de copulatie, uneori chiar la cei destinati montei naturale pentru aprecierea calitatii spermei.
Metoda utilizeaza dispozitive anale, cu lungimea de 30-35 cm si diametrul cuprins intre 6 si 9 cm, izolate electric pe toata lungimea, cu exceptia extremitatii interne, care are trei electrozi, orientati longitudinal si pozitionati ventral.
Se mai utilizeaza un electrod de forma inelara, care se introduce pe degetul aratator, protejat de manusa de cauciuc. Operatorul fixeaza acest dispozitiv la baza ampulelor canalelor deferente sau deasupra prostatei.
In pregatirea taurului donator sunt necesare urmatoarele:
contentia ferma intr-un travaliu care impiedica alunecarea, caderea din timpul aplicarii curentului electric;
vidanjarea de fecale a ampulei rectale si curatirea electrozilor, ambele in scopul realizarii unui bun contact electric al dispozitivului cu peretele rectului;
tunderea perilor preputiali, perierea si spalarea zonei invecinate, apoi uscarea acesteia;
obtinerea unui ejaculat complet, de buna calitate, este conditionata de excitarea sexuala a donatorilor sau de masarea transrectala a glandelor anexe ale aparatului genital inainte de recoltare.
Perioadele de stimulare electrica nu trebuie sa depaseasca 2-3 secunde atunci cand animalul se afla in apnee, acestea alterneaza cu pauze de 1 secunda. In mod obisnuit sunt necesare 4-19 reprize de stimulare pentru realizarea erectiei si exteriorizarea penisului si 18-35 pentru ejaculare completa; se foloseste o sursa de curent electric cu frecventa de 30-40 cicluri si o tensiune de 15-20 volti. Dupa realizarea erectiei, marirea tensiunii curentului electric aplicat grabeste ejacularea.
In timpul electroejacularii taurul este agitat, manifesta contractii tetaniforme si cifoze.
Erorile in aplicarea electroejacularii si modalitatea de corectare se refera la:
absenta erectiei – se modifica pozitia dispozitivului anal sau se impinge inainte flexura sigmoidala a penisului, actionand inapoia pungilor testiculare;
o stimulare prea frecventa a taurului in faza incipienta a electroejacularii se soldeaza cu obtinerea de lichid seminal;
aplicarea unor stimuli electrici cu parametrii prea mari va determina o preerectie si pierderea ejaculatului in preputiu.
Izolarea electrica defectuoasa a dispozitivului anal, pozitionarea sa laterala, pot induce contractura musculaturii membrului posterior ipsilateral prin excitarea nervului ischiatic. Unii tauri se inclina pe o parte si fac extensie pe membrul posterior.
Masajul ampulelor canalelor deferente si al veziculelor seminale
Aceasta tehnica are aceleasi indicatii ca si electroejacularea. Pregatirea reproducatorului este identica cu cea a electroejacularii; contentia taurului, tunderea perilor preputiali, toaleta furoului.
Se vidanjeaza ampula rectala si se trece apoi la identificarea veziculelor seminale si ampulelor canalelor deferente. Masajul se efectueaza in sens cranio-caudal pe o distanta de aproximativ 30 cm, timp de 3-5 minute, dupa care, de obicei, se produce ejacularea. In timpul eliminarii spermei, testiculele sunt usor retrase spre inelul inghinal, iar glandul iese partial din furou, fara ca penisul sa intre in erectie.
Metoda este practica si avantajoasa, nu necesita conditii speciale de recoltare, dar ea poate fi aplicata numai de specialisti cu cunostinte bune in topografia organelor aparatului genital mascul.
Factorii care limiteaza extinderea tin de urmatoarele:
Unii tauri nu raspund pozitiv la aceasta metoda. In cazul cand nu se obtine eliminarea spermei in 8-10 minute, se recomanda sa se renunte la masaj si operatiunea sa fie repetata in ziua urmatoare;
Contactul materialului seminal cu mucoasa preputiala poate determina contaminarea cu microbi a materialului seminal;
Masajul intrapelvian al diferitelor segmente ale aparatului genital poate provoca urinarea si compromiterea astfel a ejaculatului.
Recoltarea spermei la armasar
Recoltarea spermei de la armasar impune prezenta unei femele in calduri naturale sau provocate prin injectarea a 10-20 mg estradiol, cu 24-48 ore inainte de recoltare, deoarece se cunoaste ca recoltarea spermei prin metode solitare este imposibila la aceasta specie.
Prelevarea artificiala a materialului seminal la armasar urmareste sa faca posibila examinarea calitatii de reproducatori a masculilor aflati in depozite si mai rar, in scopul efectuarii insamantarilor artificiale.
Factorii limitativi pentru extinderea metodei sunt:
aspectul neomogen al ejaculatului care se datoreaza componentei spermatice cu vascozitate inalta (secretie a veziculelor seminale, care trebuie indepartata inaintea prelucrarii);
spermii cabalinelor prezinta o sensibilitate «in vitro» deosebita, fapt care afecteaza posibilitatea conservarii spermei pe termen mediu sau lung;
recoltarea spermei prezinta un grad ridicat de risc pentru personalul recoltator;
poluarea frecventa a ejaculatului cu secretiile preputiale, care sunt foarte abundente.
Materialul seminal de la armasar se obtine prin utilizarea vaginului artificial sau prin metoda fistulei uretrale (descrisa anterior).
Metoda vaginului artificial
Vaginul artificial pentru armasar se deosebeste de cel utilizat la alte specii prin dimendsiunile mai mari. Tubul vaginal este confectionat din tabla zincata, aluminiu sau mase plastice, avand lungimea de 55 cm, diametrul interior la un capat de 16 cm, iar la celalalt de 13 cm. Corpul vaginului este prevazut cu un maner ce serveste la manipularea dispozitivului.
Pregatirea pentru recoltare consta in spalarea si dezinfectarea riguroasa a penisului si furoului.
Pregatirea partenerei pentru recoltare consta in contentionarea acesteia cu ajutorul platlogelor si iavasalei; baza cozii se infasoara cu o banda de tifon. Armasarul este introdus in sala de recoltare de doi ingrijitori cu ajutorul a doua pene de capastru. Tehnicianul ce recolteaza sperma, se aseaza in partea dreapta a iepei si tine cu mana dreapta vaginul artificial sprijinit de grupa acesteia sub un unghi de 35-40(C. Cand armasarul face saltul, operatorul cu mana stanga prinde penisul de la baza si il dirijeaza in lumenul vaginului. Dupa ejaculare vaginul artificial impreuna cu penisul se dirijeaza cu paharul colector in jos, pentru ca sperma sa se scurga pe peretii ei. In asa pozitie vaginul artificial se tine pana se termina eliminarea spermei. Eliminarea spermei la armasar este insotita de incetarea miscarilor de copulatie si a contractiei ritmice a muschilor bazei cozii. Ejacularea la armasar dureaza 10-20 secunde, iar volumul ejaculatului constituie 50-100 ml.
Dupa recoltare sperma se filtreaza printr-un tifon steril, pentru indepartarea smegmei si masei gelatinoase existente in ejaculat (secretia veziculelor seminale).
Recoltarea spermei la vier
La vier sperma poate fi recoltata cu vaginul artificial si prin masturbati (metoda manuala). Spre deosebire de alte specii, la suine se realizeaza usor recoltarea solitara, pe manechin.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial
Vaginul artificial pentru vier, spre deosebire de vaginul altor specii, prezinta unele particularitati, cu toate ca principalele parti componente sunt aceleasi: tubul vaginal, camasa vaginala, tubul prelungitor de cele mai multe ori se foloseste o bucata de camasa vaginala din vaginul artificial pentru tauri. De obicei tubul vaginal, confectionat din cauciuc, are lungimea de 30 cm, diametrul de 8-10 cm. Camasa vaginala are lungimea de 40-45 cm, iar tubul prelungitor de 20-25 cm. Recipientul colector cu capacitatea de 500-1000 ml este confectionat din sticla (un borcan obisnuit) sau material plastic cu peretii dubli, intre care se toarna apa calda. Pentru indepartarea fractiunii gelatinoase din sperma (secretul glandelor bulbo-uretrale), la gura recipientului colector se ataseaza un filtru de material plastic sau o bucata de tifon, care se fixeaza cu un inel de cauciuc.
Recoltarea spermei la vier se face pe un manechin de porc, confectionat din scandura si acoperit cu musama. In interiorul manechinului este prevazut un dispozitiv special, unde se aseaza vaginul pregatit. Dispozitivul pentru vaginul artificial se incalzeste cu lampi electrice.
Pe peretii laterali ai manechinului se monteaza doua cuie de lemn pentru sprijinirea membrelor anterioare ale vierului in timpul saltului. Pentru deprinderea vierului sa indeplineasca salturi pe manechin la inceput se admit cateva monte cu scroafe aflate in calduri, ulterior scroafa se inlocuieste cu un manechin acoperit cu o piele scoasa de pe o scroafa sanatoasa sacrificata. Reflexele sexuale se intaresc dupa 1-3 salturi pe manechin, insotite de reflexul ejacularii. Unii masculi reproducatori repede manifesta reflexele sexuale pe manechin daca in prezenta lor se recolteaza sperma de la vierii deja deprinsi sa efectueze saltul pe manechin. Reproducatorii de asemenea bine manifesta reflexele sexuale pe manechin, daca cel din urma este stropit cu sperma de vier sau secretia din vaginul unei scroafe in calduri. Manechinul, dupa fiecare recoltare, se spala cu apa calda si sapun, se sterge cu un prosop, apoi se dezinfecteaza cu o solutie de 2% de cloramina sau 3% de peroxid de hidrogen.
Metoda manuala de recoltare a spermei
Este o metoda simpla si nu necesita o aparatura complicata, permitand obtinerea de ejaculate de buna calitate. Ea se efectueaza tot pe manechin.
Imediat dupa saltul si imbratisarea manechinului vierul executa cateva miscari de incercare a intromisiunii. In acest moment operatorul fixeaza extremitatea spiralata a penisului cu mana acoperita cu o manusa din cauciuc. Fixarea manuala a organului copulator desavarseste erectia, completa sa exteriorizare fiind facilitata de tractionarea moderata a penisului, care este dirijat anterolateral si ventral.
Ejacularea la vier incepe aproape imediat dupa contactul penisului cu mana recoltatorului, dureaza in medie 4-6 minute, timp in care vierul donator este linistit si imbratiseaza cu putere manechinul.
Ejaculatul va fi recoltat intr-un pahar colector la 38-40(C, avandu-se grija ca paharul sa fie acoperit cu un tifon, care retine partea gelatinoasa (secretia bulbo-uretrala). De asemenea, primele fractiuni ale ejaculatului (fractiunea prespermatica, lipsita de spermi si cu continut ridicat de microorganisme) se vor inlatura colectand numai, odata cu aparitia primelor jeturi «laptoase», sperma bogata in spermi.
Recoltarea spermei de la berbec
Recoltarea spermei de la berbec, in mod obisnuit, se executa cu ajutorul vaginului artificial si numai in cazuri exceptionale, mai ales in scop experimental, se realizeaza prin electrocutare.
Recoltarea spermei cu vaginul artificial
Vaginul artificial pentru prelevarea spermei la berbeci are lungimea de 20 cm si diametrul de 5 cm. Pentru provocarea ejacularii este necesara asigurarea unei temperaturi de 41-44(C si a unei presiuni de 40-60 mm coloana de mercur; din punct de vedere conceptional acest dispozitiv este identic cu cel utilizat la taurine.
Recoltarea spermei la berbec se face in camera de recoltare amenajata, unde este adusa o oaie in calduri sau un castrat, care trebuie contentionat intr-un travaliu. Tehnicianul se aseaza in partea dreapta a berbecului, stand pe genunchiul drept, iar cu mana dreapta tine vaginul artificial apropiat de crupa animalului, sub un unghi de 35(. In acest timp mana stanga o tine pe furoul berbecului. Cand masculul face saltul pe femela (castrat), operatorul dirijeaza penisul spre lumenul vaginului artificial. La putin timp dupa ce penisul a fost introdus, berbecul efectueaza brusc miscarile caracteristice reflexului de ejaculare. Masa spermatica este proiectata in paharul colector. Odata cu coborarea masculului de pe femela, vaginul artificial se scoate de pe penis, se dirijeaza cu paharul colector in jos si se tine in pozitie verticala pentru ca sperma ramasa pe peretii camerei sa se scurga in paharul colector. Dupa aceasta paharul colector se scoate si se transmite in laborator.
Recoltarea spermei prin electroejaculare
La berbeci, electroejacularea prezinta unele deosebiri fata de tehnica descrisa la taurine. Berbecii se fixeaza in decubit lateral drept, de obicei pe o scara, ce se aseaza pe sol sau masa de lucru. Se face toaleta regiunii furoului cu o solutie de bicarbonat de sodiu, se extrage penisul din furou, actionand asupra flexiunii sigmoidale, se fixeaza cu o mesa sterila, ce se trece pe la baza glandului, astfel ca apendicele vermiform sa fie introdus in recipientul colector.
Dispozitivul bipolar anal, cu lungimea de 30 cm si diametrul de 2 cm se insera in rect pana in dreptul regiunii lombare, circa 15 cm (se stabileste contactul electric, dandu-se excitatii electrice in serii de cate 5 secunde la intervale de 10 secunde. Sperma este ejaculata dupa 3-5 reprize, deoarece actul se produce fara erectie. Berbecii reactioneaza mai promt la electroejaculare.
Dispozitivul se conecteaza la o sursa de curent electric continuu cu valori ale tensiunii de 2,5 si 8 volti.
Examinarea si aprecierea spermei
Pentru aprecierea fertilitatii unui reproducator, controlul calitatii materialului seminal constituie un factor esential. Fecunditatea unui mascul este in functie de cantitatea si calitatea spermei. Notiunea de calitate a spermei se refera la insusirile macro- si microscopice ale ejaculatului, corelate cu fertilitatea spermilor.
Importanta controlului si evaluarii ejaculatelor rezulta din:
necesitatea cunoasterii calitatii ejaculatelor inainte de a se proceda la diluare, in vederea excluderii celor necorespunzatoare;
necesitatea stabilirii gradului de dilutie optim, al fiecarui ejaculat in parte;
necesitatea verificarii calitatii spermei diluate atat la diferite etape de prelucrare, cat si in urma conservarii;
necesitatea aprecierii calitatii de reproducatori la masculii folositi la monta naturala.
Pentru evaluarea cantitatii si calitatii spermei (ejaculatelor) se folosesc metodele de laborator, care pot fi:
macroscopice;
microscopice;
biochimice;
bacteriologice.
Aprecierea definitiva a fecunditatii unui mascul reproducator se va face in urma obtinerii rezultatului probei biologice, coroborata cu capacitatea productiva a descendentilor (testul dupa descendenta).
Controlul spermei prin metode de laborator
Indiferent de scopul in care s-a realizat, dupa prelevare sperma este examinata pentru evaluarea insusirilor macroscopice si microscopice. Acest examen se efectueaza imediat dupa recoltare, prin asigurarea tuturor cerintelor pentru a mentine sperma «in vitro» si a nu deteriora calitatea acesteia.
In acest scop:
se va utiliza un echipament curat, fara urme de substante chimice (alcool, antiseptice de orice fel), agent lubrifiant, lichid preputial, apa sau urina;
sticlaria de laborator trebuie sa fie confectionata din sticla neutra, curata, sterilizata si incalzita pana la temperatura fiziologica (37-38(C);
ejaculatul nu se va expune la lumina solara directa si se va evita variatia de temperatura a ejaculatului care determina socarea termica a spermilor.
Examenul macroscopic
Prin examen macroscopic se apreciaza volumul ejaculatului, culoarea spermei, mirosul, densitatea si prezenta valurilor spermatice.
Volumul ejaculatului
Volumul ejaculatului difera in functie de specie, iar in cadrul speciei de la o rasa la alta si chiar la acelasi reproducator, de la un ejaculat la altul. Deterinarea volumului ejaculatului se poate stabili in paharul colector sau in cilindrii gradati.
In conditii optime de recoltare, volumul ejaculatului se mentine in limite constante. Utilizarea unor metode de stimulare sexuala, cum ar fi prezenta unei femele in calduri, masarea transrectala a anexelor aparatului genital al masculilor si altele, pot mari volumul ejaculatului si numarul de spermi din sperma. La masculii tineri volumul ejaculatului este mai redus, in comparatie cu cel al masculilor adulti.
Din contra, aplicarea unor tehnici de recoltare neadecvate, o frecventa ridicata a recoltarilor, starea de boala, inflamatia unor anexe ale aparatului genital, precum si alti factori, cum ar fi alimentatia, intretinerea si exploatarea nerationala pot provoca reducerea volumului materialului seminal (oligospermatismul) sau chiar sistarea completa a ejacularii (aspermatismul).
Desi in practica insamantarilor artificiale s-au stabilit valori minime ale principalelor insusiri ale spermei, mai jos de care ejaculatele nu se prelucreaza, fecunditatea masculilor nu este afectata de scaderea volumului spermei, renuntarea la prelucrarea lor este motivata din punct de vedere economic.
Culoarea spermei
Culoarea spermei difera putin de la o specie la alta, dar se afla in corelatie stransa cu concentratia de spermi: la taur si berbec este alba sau asb-crema; la vier este alba-laptoasa, cu reflexe albastrui; la armasar este albicioasa, usor cenusie si opaca; la cane sperma are un aspect apos si usor tulbure, fiind semitransparenta.
Abaterile de la aspectul si culoarea considerate normale se datoreaza:
culoarea maronie apare in orhite si se datoreaza pigmentilor sanguini;
culoarea roz-rosietica a spermei evidentiaza prezenta in ejaculat a sangelui care extravazeaza din tractusul genital, uretra sau penis;
culoarea galbuie denota ca sperma este amestecata cu urina;
flocoanele de puroi modifica culoarea spermei conferindu-i ejaculatului un aspect neomogen; ele provin din ampulele canalelor deferente sau glandele anexe ale aparatului genital;
infectiile cu Pseudomonas spiralis modifica in galben-verzui culoarea spermei.
In toate aceste cazuri sperma nu poate fi folosita.
Mirosul spermei
Este specific si se aseamana cu cel al mucilagiului de amidon. In cazul cand sperma prezinta alte mirosuri care nu corespund cu cel mentionat, acest lucru indica prezenta unor procese inflamatoare la nivelul cailor genitale si, in acest caz, se modifica si culoarea.
Aprecierea valorilor spermatice
La unele specii prin examen macroscopic, in functie de densitatea si mobilitatea spermilor se poate constata prezenta valurilor, de diferite intensitati, provocate de miscarile gametilor. Acest lucru este vizibil in sperma deasa, proaspat recoltata, la rumegatoare, care prezinta particule fine in continua miscare (mai ales la berbec), asemanatoare cu niste valuri, care se agita in paharul colector sau intr-o lama exavata. Sperma mijlocie si rara nu prezinta valuri spermatice.
Examenul microscopic al spermei
Acest examen furnizeaza date mai sigure despre calitatea ejaculatului si permite sa se aprecieze densitatea si concentratia spermei, mobilitatea spermilor, procentul de spermi viabili, teratologici sau imaturi etc.
Aprecierea densitatii spermei
Densitatea spermilor in sperma difera de la o specie la alta, iar in cadrul speciei se constata variatii intre reproducatori si chiar la acelasi reproducator intre doua ejaculate. Stabilirea densitatii spermei consta in aprecierea la microscop a distantei dintre doi spermi. Cu o pipeta sterila se ia o picatura de sperma si se pune pe o lama degresta incalzita sau pe o placuta incalzitoare. Lama se acopera cu o lamela, avand grija sa nu se formeze intre ele bule de aer. Astfel pregatite, se examineaza cel putin ? campuri microscopice. In functie de distantele dintre doi gameti, se deosebesc mai multe categorii de sperma:
Sperma densa se noteaza cu «D», campul microscopic este plin cu spermi, distanta dintre gameti este mai mica decat lungimea capului unui sperm. Se constata o concentratie de peste 1 miliard de spermi la un mililitru.
Sperma mijlocie (M), are o concentratie de 0,5-1 miliard de spermi pe ml, iar distanta dintre doi spermi este egala cu lungimea capului unui gamet.
Sperma rarefiata (R) corespunde unei concentratii mai mici de sub 0,5 miliarde spermi/ml; distanta dintre doi spermi este mai mare decat lungimea capului, ajungand pana la lungimea unui gamet.
Sperma foarte rara (oligospermie) (O) prezinta doar cativa spermi in campul microscopic.
Azoospermie (A) denota lipsa spermilor din sperma.
In mod normal, la taur, berbec si tap se intalneste sperma densa si mijlocie, iar la vier si armasar – sperma rara. La vier se poate intalni sperma mijlocie cand recoltarea spermei se intrerupe inainte de fractiunea postspermatica. La pasari sperma este deasa.
Determinarea concentratiei spermei.
Concentratia spermilor pe unitatea de masura, de obicei miliarde pe milimetru, are mare importanta in procesul de prelucrare a materialului seminal. De numarul de spermi din ejaculat si de mobilitatea lor depinde gradul de dilutie a spermei.
Aprecierea concentratiei spermilor dintr-un ejaculat se poate realiza prin metoda hemocitocolorimetrica, fotocolorimetrica, electronica etc.
Metoda hemocitometrica
Se bazeaza pe principiul similar cu cel de apreciere a elementelor figurate din sange, folosindu-se camerele de numarat de tip Goreaev, Thoma, Burker etc. si pipetele Potain.
In pipeta Potain se aspira sperma pana la diviziunea de 0,5 si se completeaza cu o solutie de clorura de sodiu 3%, pana la diviziunea 101 (pentru sperma de berbec si taur) sau 11 (pentru sperma de vier si armasar). Pipeta se mentine in pozitie verticala pentru a se evita formarea bulelor de aer. In continuare se prind capetele pipetei intre pulpa degetului mare si a celui mijlociu si se agita bine continutul acesteia, pentru a se face omogenizarea lui cu ajutorul margelelor (albe sau rosii) care se gasesc in ampula pipetei. Se elimina 2-3 picaturi de sperma diluata si apoi se depune o picatura pe reteaua camerei de numarat Goreaev pe care, in prealabil, s-a asezat o lamela.
Se procedeaza in continuare la numararea spermilor din 5 patrate mari (respectiv 80 de patratele), luate in diagonala retelei.
Concentratia de spermi in sperma/mm3 se calculeaza dupa formula:
, in care:
N – numarul de spermi numarati in 5 patrate;
I – inaltimea sau adancimea camerei (1/10mm);
S – suprafata unui patratel (1/400 mm2);
D – gradul de dilutie a spermei (1/200 pentru sperma de taur si berbec si 1/20 pentru sperma de vier si armasar);
n – numarul patratelelor in care s-au numarat spermii (80).
In cazul spermei de taur si berbec, cu gradul de dilutie de 1/200, inlocuind formula se obtine: sau , sau formula simplificata este: C=Nx10000 si pentru a afla numarul de spermi intr-un mililitru de sperma, rezultatul se inmulteste cu 1000.
In cazul spermei de vier si armasar, cu gradul de dilutie de 1/20, formula simplificata pentru aprecierea concentratiei gametilor este: C=Nx1000, iar pentru exprimarea concentratiei in spermi/ml rezultatul de asemenea obtinut se mai inmulteste cu 1000.
Metoda fotocolorimetrica
Este o metoda rapida de numarare care se bazeaza pe diferitele grade de opacitate pe care le are sperma pusa in fata unui fascicul de lumina ce trece prin dreptul unei celule fotoelectrice.
In practica se folosesc fie fotocolorimetre ce indica direct numarul de spermi in miliarde, fie fotocolorimetre ce trebuie in prealabil etalonate prin masuratori repetate executate prin metoda hemocitometrica.
Metoda electronica
Principiul metodei se bazeaza pe modificarea de catre spermi a campului electronic creat de 2 electrozi din platina, plasati intr-un capilar de pasaj al spermei. Exista diferite tipuri de aparate electronice cel mai utilizat fiind tipul Coulter.
Aprecierea mobilitatii spermilor
Mobilitatea spermilor se apreciaza in functie de miscarile spermilor, care se pot urmari cu usurinta in campul microscopic. In functie de aspectul miscarilor, intr-o picatura de sperma aplicata pe o lama si acoperita cu o lamela, la temperatura fiziologica, putem intalni mai multe categorii de spermi si anume:
spermi cu miscare de inaintare sau rectilinie;
spermi cu miscari circulare sau «in manej»;
spermi cu miscari vibratorii sau ondulatorii;
spermi fara miscari (morti).
Poseda fecunditate numai spermii care au miscari de retropulsie (pendulare), «in manej» si cei imobili.
In cazul cand toti spermii din campul microscopic sunt imobili (morti), sperma respectiva se noteaza cu «N» (necrospermie).
Deoarece o mare varietate de factori fizico-chimici si biologici afecteaza mobilitatea spermilor, examinarea spermei trebuie efectuata imediat dupa recoltare, evitandu-se variatiile de temperatura (socul termic), poluarea cu apa, urina, alte substante chimice, lubrefianti etc. La speciile cu sperma foarte deasa (berbecul), pentru facilitarea examinarii microscopice a spermei este indicata diluarea materialului seminal cu o solutie citrata sau cu clorura de sodiu, sol. 1%.
Pentru aprecierea mobilitatii spermilor, la noi in republica se foloseste sistemul notelor de la 10 la 1.
Conform acestui sistem, aprecierea activitatii sau mobilitatii spermilor se face astfel:
10 puncte – cand toti spermii au miscare rectilinie;
9 puncte – cand 90% au miscare de inaintare;
8 puncte – cand 80% au miscare de inaintare;
…2 puncte – cand 20% au miscare de inaintare.
In mod obisnuit, se admit pentru prelucrare ejaculatele notate cu cel putin 8 puncte la taur si berbec si 6-7 puncte la vier si armasar, (60-80% spermi cu miscari active de inaintare).
Spermii care prezinta altfel de miscari (circulatorii, ondulatorii, retrograde impreuna cu cei cu miscari de inaintare foarte lente sau agonice primesc aceeasi apreciere ca si spermii morti.
Examenul morfologic al spermilor
In sperma reproducatorilor domestici se intalnesc frecvent, in proportii variabile, spermi cu diferite anomalii (teratologici), precum si spermi imaturi, care pot influenta negativ fecunditatea, cand procentul acestora depaseste anumite limite. Pentru acest motiv, examenul spermei trebuie completat si cu determinarea raportului de spermi teratologici si imaturi.
Anomaliile morfologice ale gametilor se pot incadra in:
anomalii primare, determinate de tulburarea spermiogenezei, avand o localizare in tubii seminiferi, pana la ajungerea in epididim si constau in alterarea morfologica si structurala a capului spermului;
anomalii secundare, care se produc in epididim datorita stagnarii prelugite la acest nivel, sau sunt efecte ale actiunii unor factori termici (socul termic), chimici sau mecanici din timpul ejacularii si manipularii spermei. Anomaliile secundare vizeaza alterarea piesei intermediare sau a cozii gametilor.
Anomaliile capului pot fi de forma si marime si se refera la micro- si macrocefalie, spermi cu capul dublu sau multiplu, cap alungit si ingust, in forma de para, neregulat si mic – sferic. Alte anomalii ale capului spermului constau in cap detasat (liber) si invaginarea invelisului nuclear.
Anomaliile acrozomului se refera la: acrozom aplatizat, incomplet, curbat sau detasat.
Piesele intermediare anormale pot fi: ingrosate, rasucite, cu noduri duble, gat filiform si cu picatura protoplasmatica proximala sau distala. In procesul maturarii epididimare a spermilor picaturile protoplasmatice migreaza de la gat spre extremitatea distala a piesei intermediare si dispare de regula inaintea ejacularii; aceasta migrare a picaturii protoplasmatice se realizeaza in capul epididimului. Intr-un ejaculat normal, procentul spermilor cu picatura protoplasmatica (imaturi) nu trebuie sa depaseasca 2-3% la berbec si taur si 10% la vier si armasar. Depasirea acestui procent denota epiuizarea sexuala a masculilor.
Afectiunile epididimului altereaza conformatia normala a piesei intermediare, fapt care reduce mobilitatea spermilor si se asociaza cu infecunditatea.
Examenul morfologic al spermilor poate depista unele forme de anomalii ale cozii: cozi duble sau rasucite, scurte sau absente, picaturi protoplasmatice localizate proximal sau distal.
Dupa datele din literatura de specialitate, procentul maxim de spermi anormali (teratologici) admisi in sperma de taur este de 18%, inclusiv 3-4% cu anomalii ale capului, 4-10% - la piesa intermediara si 0,5-2% - la coada spermului.
Berbecii cu o fecunditate normala nu depasesc 14% incidenta a spermilor anormali; vierii si armasarii au in medie 20% de spermi teratologici.
Determinarea spermilor anormali se face prin utilizarea diferitor metode de colorare, care permit atat aprecierea de ansamblu a gametilor, cat si anumitelor aspecte legate de structura lor. Determinarea spermilor cu anomalii primare sau secundare sau a celor imaturi, se poate face prin efectuarea unor frotiuri din sperma, care apoi se coloreaza cu: Giemsa rapid, fuxina Pfeiffer, solutie albastru de metilen 1%, eozina 5%, hematoxilina etc.
Din sperma proaspat recoltata se prepara mai multe frotiuri, care se fixeaza prin uscare la aer sau in alcool 96(, timp de 2 minute. Dupa fixare se procedeaza la colorarea cu o solutie din cele mentionate timp de 3-5 minute. Frotiurile colorate se spala sub un jet mic de apa, se usuca si apoi se examineaza la microscop cu putere de marire de 200-400 ori. In timpul examenului microscopic se noteaza separat numarul de spermi normali si al celor cu anomalii, pana se examineaza cca 500 spermi. Pe baza numarului de spermi examinati se calculeaza proportia dintre cei anormali si normali.
Determinarea proportiei de spermi vii si morti
Se poate realiza printr-o coloratie intravitala, compusa din 3 gr citrat de sodiu, 100 ml apa distilata, 1 gr eozina si 5 gr negrozina. Membrana celulara a spermilor morti devine permeabila la eozina, astfel ca acestia se coloreaza in rosu, in comparatie cu spermii vii, care raman necolorati.
Calculul acestei proportii rezulta din numararea a 100-500 celule spermatice si exprimarea procentuala a gametilor vii si morti dintr-un ejaculat.
Teste biochimice pentru aprecierea calitatii spermei
In practica insamantarilor artificiale, testele biochimice sunt putin folosite, totusi cu valoare de diagnostic sunt: testele de rezistenta termica, rezistenta la solutii hipertonice si testul reducerii albastrului de metilen.
Proba biologica
Rolul hotarator in analiza spermei il are aprecierea fecunditatii spermilor, realizata prin proba biologica. Conceptia (fecunditatea) depinde de gradul de inrudire al femelei cu masculul, de starea sanatatii reproducatorilor (femelei si masculului), conditiile de alimentatie si intretinere etc. De aceea, pentru aprecierea fecunditatii unui reproducator se alege un grup de femele tinere, nulipare, cu stare de sanatate perfecta, care se monteaza sau se insamanteaza artificial cu sperma masculului respectiv. Dupa numarul femelelor devenite gestante se fac concluzii asupra capacitatii de fecundare a reproducatorului. Astfel, se considera normala sperma unui reproducator care realizeaza instalarea gestatiei, dupa prima insamantare, la 70-75% din femele.
Diluarea spermei
Diluarea si conservarea materialului seminal sunt operatii prin care se asigura mentinerea viabilitatii si puterii fecundative a spermilor un timp variabil in afara cailor genitale.
Practicarea insamantarilor artificiale arata ca intr-un diluant bine pregatit si ales spermii isi pastreaza viabilitatea si celelalte insusiri biologice un timp mai mult mai indelungat decat in mediul natural. Aceasta se explica prin urmatoarele.
In primul rand, plasma seminala, constituita din secretiile anexelor testiculare si ale glandelor anexe ale aparatului genital nu serveste ca mediu ideal pentru pastrarea spermilor in afara organismului. Secretia slab alcalina a prostatei stimuleaza mobilitatea spermiilor, care pana la acest moment se aflau in canalul epididimar, in stare de anabioza. Acest fenomen este important pentru a asigura inaintarea spermilor prin caile genitale femele si fecundarea normala a ovulelor. Insa, activarea mobilitatii si mentinerea viabilitatii spermilor de catre produsul de secretie al glandelor anexe este insotita de distrugerea tegumentului lipoproteic al spermilor sub actiunea ionilor de Na+ si K-, care se contin in plasma seminala. Ionii de Na+ si alte metale neutralizeaza incarcatura electrica negativa a spermilor si provoaca aglutinarea lor.
Alta cauza care duce la peirea spermilor in afara organismului este diminuarea resurselor energetice pentru metabolismul celulelor spermatice si, in primul rand, al zaharurilor. Glucoza este considerata sursa principala de energie a spermilor atat in mediu aerob, cat si in cel aerob. La sperma cu o concentratie ridicata si bogata in fructoza (taur, berbec) se constata diminuarea intr-un timp foarte scurt a pH-ului rezultat din acumularea acidului lactic, deci din fructoliza. Ritmul cresterii aciditatii dupa ejaculare are o semnificatie importanta; acidul lactic actioneaza negativ asupra spermilor, iar concentratiile mari ii omoara. Scaderea sau absenta sarcinii electrice, care are loc mai ales in urma acidifierii mediului, este urmata, de asemenea, de aglutinarea spermilor.
Unul din factorii importanti ai mediului care actioneaza asupra spermilor este temperatura. La coborare brusca, mai ales sub +18(C spermii sunt supusi socului termic si mor.
Prin urmare, cauzele concrete care duc la peirea spermilor in afara cailor genitale sunt:
subnutritia spermilor ca urmare a epuizarii rezervelor energetice din gameti si plasma seminala;
intoxicatia spermilor cu produsele metabolice;
deteriorarea tegumentului lipoproteic, exfolierea membranei celulei spermatice si pierderea sarcinii electrice negative datorita acumularii in plasma seminala a acidului lactic;
actiunea negativa asupra spermilor a bacteriotoxinelor si bacteriolizinelor;
variatiile de temperatura care provoaca socul termic.
De aceea, pentru prelungirea viabilitatii spermilor in afara organismului se impune:
reducerea activitatii cinetice a celulelor spermatice;
asigurarea gametilor cu substante nutritive;
protejarea spermilor de distrugerea tegumentului lipoproteic si al membranei celulei spermatice;
diminuarea intoxicatiei spermilor prin diluarea plasmei seminale.
Toate aceste conditii le asigura mediile de dilutie care contin ingridienti cu proprietati protectoare, nutritive, neutralizante etc.
In afara de asigurarea mediilor favorabile pentru prelungirea viabilitatii spermilor «in vitro», diluarea spermei urmareste si alte obiective, printre care: cresterea volumului total al ejaculatului si posibilitatea de a insamanta un numar cat mai mare de femele dintr-un ejaculat.
Principiul stiintific care sta la baza diluarii spermei este acela ca din numarul total de spermi depusi de un mascul in caile genitale feminine prin monta, numai un procent mic de spermi (la taur circa 5%) participa la fecundarea ovulului, iar restul mor. In practica s-a demonstrat ca pentru a obtine o rata normala de fecundare la vaca spre exemplu, pentru insamantare sunt necesare intr-o doza de sperma diluata, 12-25 milioane de spermi vii, insa conform cercetarilor mai recente, numai 10 mln si chiar 5 milioane de gameti. Rezulta ca la stabilirea gradului de dilutie a materialului seminal trebuie sa se rezerveze, pentru o doza de inoculare, un minim de 10-12 milioane de spermi cu miscari active de inaintare.
Se admit pentru diluare si conservare numai ejaculatele care se incadreaza in anumiti parametri, in functie de specie, asa cum rezulta din tabelul urmator.
Valorile medii si minimale ale principalelor insusiri ale spermei admise pentru diluare
Specia
Volumul ejaculatului (ml)
Concentratia spermei (miliarde spermi/ml)
Mobilitatea spermilor (puncte)
Procentul maxim de spermi anormali
Media
Minim admisibil
Media
Minim admisibil
Media
Minim admisibil
Taur
4,0
3,0
1,2
0,6
9
8
18
Berbec
1,0
0,6
3,0
2,0
9
8
14
Armasar
75,0
40,0
0,12
0,05
6-7
5
20
Vier
250,0
150,0
0,15
0,1
7-8
7
20
Conditiile pe care trebuie sa le indeplineasca un diluant pentru conservarea spermei
Mentinerea fecunditatii unei sperme un timp mai indelungat dupa recoltare este in functie de calitatea diluantului si metoda de conservare.
In procesul de prelucrare a materialului seminal se utilizeaza solutii diluante, care trebuie sa intruneasca urmatoarele proprietati:
sa fie izoterme – temperatura solutiei diluante, a sticlariei diverse cu care sperma intra in contact in timpul procesului trebuie sa aiba valori apropiate, evitandu-se astfel deteriorarea mobilitatii prin soc termic;
sa fie izoterme cu sperma – presiunea osmotica adecvata a diluantului se regleaza prin echilibrarea cantitativa a ingredientilor; citratul de sodiu realizeaza un mediu izotonic cu sperma;
sa aiba un pH apropiat de cel al plasmei seminale (6,2-6,8 pentru sperma de taur si berbec si 7,0-7,2 pentru cea de vier si armasar);
sa contina substante nutritive pentru spermi; adaosul de glucoza, fructoza sau alte hexoze la diluant reprezinta substratul energetic pentru metabolismul anaerob al celulelor spermatice; alaturi de alte ingrediente, acestea permit prelungirea semnificativa a duratei de viata a spermilor. Fosfolipidele din lapte, lecitina si lipoproteinele din galbenusul de ou reprezinta componentele nutritive si spermioprotectoare.
Tot in galbenusul de ou se remarca prezenta triptofanului, tirozinei si fenilalaninei, care au rol important in procesele de dezaminare oxidativa din sperma, iar colesterolul si carotenul stimuleaza activitatea succinica, malica si gliceroaldehid-3-fosfat-dehidrogenazica in spermi. Alti compusi din galbenus actioneaza ca protectori ai enzimelor sulfhidrilice, servind in cadrul proceselor oxidative si ca factori antiaglutinanti in sperma;
sa contina substante crioprotectoare – crioprotectia este asigurata de glicerina, galbenusul de ou, lapte sau dimetilsulfoxid, substante care impiedica cristalizarea apei de constitutie si pe aceasta cale, deteriorarea ireversibila a membranei celulare a spermilor in timpul congelarii.
sa posede o actiune bacteriostatica si chiar bactericida – adaosul de antibiotice sau sulfamide in concentratii bacteriostatice impiedica multiplicarea microorganismelor din sperma, proces care determina elaborarea unor endo- si exotoxine bacteriene, ambele extrem de toxice pentru celulele spermatice.
Apa din componenta diluantului trebuie sa fie distilata sau deionizata, deoarece ionii metalelor au un efect toxic asupra spermilor, in caz contrar se utilizeaza substante chelatoare, care complexeaza acesti ioni.
Clasificarea diluantilor pentru sperma
Clasificarea diluantilor se face dupa urmatoarele criterii: compozitie, scopul si specia la care se utilizeaza.
Dupa scopul in care sunt folositi diluantii pot fi clasificati in felul urmator:
diluanti pentru conservarea spermei la temperatura camerei;
diluanti pentru conservarea spermei prin refrigerare;
diluanti pentru conservarea spermei prin congelare.
In functie de compozitie diluantii se impart in urmatoarele grupe:
1 – diluanti salini (cristaloizi). Se bazeaza pe folosirea substantelor chimice (citrati, fosfati, tartati, sulfati etc.) la care se adauga galbenus de ou pentru protejarea spermilor de socul termic si glucide (glucoza, fructoza, lactoza etc.). La ora actuala diluantii salini sunt cei mai utilizati pe plan mondial, incat ei prezinta 70% din numarul total, folositi la conservarea spermei. Exemplificam cativa diluanti salini:
Diluanti cu galbenus de ou
Apa distilata 100 ml
Citrat de sodiu + 2H2O 2,9 grame
Galbenus de ou 20%
Se prepara solutie salina din 29 grame citrat de sodiu si 1 litru de apa bidistilata, apoi se sterilizeaza prin fierbere sau autoclavare. In ziua diluarii spermei se adauga 20% galbenus de ou proaspat. La intregul diluant apoi se adauga antibiotice: 1000 UI penicilina si 500-1000 gama dehidrostreptomicina. Se pot folosi concentratii diferite de citrat de sodiu: 3,2-3,6% in loc de 2,9 gr%.
Galbenus de ou citratat si glucoza
Citrat de sodiu (Na3C6H5O7) cristalizat cu 2 H2O 1,15 gr
Glucoza anhidra 3,00 gr
Apa distilata 100,0 ml
Galbenus de ou 20,0 ml
Galbenus de ou citratat si fosfatat
Fosfat acid de potasiu (PO4H2K) 0,2 gr
Fosfat acid de sodiu (PO4HNa) cristalizat
cu 2 molecule de H2O 2,0 gr
Apa distilata ad. 100 ml
Dupa racire se adauga galbenus de ou 20-25%
Galbenus de ou citratat cu glicerina
In diluantul cu galbenus de ou citratat se adauga 2-10% glicerina pura. Dupa 3 zile de conservare, acest diluant prezinta o fecundatie mai buna decat a diluantului galbenus de ou citratat neglicerinat.
Diluantul TRIS cu galbenus de ou glicerinat, fructoza si acid citric
Tris hidroximetil-aminometan 6,056 gr
Acid citric 3,0 gr
Fructoza 2,5 gr
Apa distilata 166,320 gr
Dupa prepararea solutiei se incalzeste la 90(C, apoi se raceste si se imparte in doua jumatati egale. Inainte de folosirea uneia din parti se adauga 15,840 grame de apa bidistilata, 25 grame galbenus de ou proaspat, 0,1 grame streptomicina si 100000 UI penicilina G. La cealalta parte a diluantului se adauga 19,68 grame glicerina pro analisis, 25 grame galbenus de ou proaspat, 0,1 grame streptomicina si 100000 UI penicilina G; pH trebuie sa fie ajustat la 6,85.
|